本篇研究我们通过对刀鲚HSP70片段的克隆以及对目的基因序列的研究证实了（Coilia nasus）刀鲚HSP70片段基因在刀鲚鱼体的各个器官普遍表达，并且在血、肝、精巢、卵巢中的表达量最高，发现了HSP70基因在刀鲚精子的发生期和产卵期高表达。这说明HSP70基因对刀鲚精巢的发生有密切关系，该研究为解决洄游生殖型鱼类雄性生殖极其薄弱的现状提供了一个新的研究方向，为解决多年来为长江刀鲚的人工繁育问题和资源衰减问题以及今后的分子遗传辅助育种提供理论参考。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1．1 实验材料及数据来源 2
1．2 总RNA的提取 2
1．3 cDNA第一链的合成 3
1．4 目的片段的获得 3
1．5 PCR 产物回收纯化与克隆测序 4
1．6 基因片段序列分析 4
1．7 基因表达谱分析 4
1．7. 1 RTPCR 4
1．7. 2 qRTPCR分析 5
1．8 数据统计分析 5
2 结果与分析 5
2．1 HSP70 cDNA的特性 5
2．2 CnHSP70的表达模式分析 6
3 讨论 7
4 结论 8
致谢 8
参考文献 9
长江刀鲚精巢HSP70的克隆及其在精子发生中的作用初探
水产养殖 陈蕾
引言
热休克蛋白 (Heat shock proteins, HSPs)是一类最广泛存在和高度保守的多基因超家族，这类多基因超家族成员因为它们的蛋白伴侣功能参与发育调控机制[12]以及参与抗化学、物理和病理等的分子耐受机制调控[3、4]而受到广泛的关注。根据这些多基因超家族成员编码氨基酸的相对分子量将他们分为：HSP 100，HSP 90，HSP 70，HSP 60和小HSPs[5]等亚家族。在这些不同亚家族的热激蛋白中，HSP70是保守性最高，而且也是在真核生物 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ^351916072* 
中研究最为深入的一类[6]。研究发现，一些HSP70在精巢和精子中高度表达，一种精巢特异的HSP702最先在老鼠的精巢中被鉴定出来[7]，这种精巢特异的HSP702参与雄性老鼠生殖细胞的调控并特异地在生殖细胞中表达[2]。
精子发生是一个界限分明的，精确同步且时空合理的生物学过程，这种时空进程为生殖细胞分化过程中基因的调控机制研究提供了良好的生物学模型。精子发生过程可以分为明显的三个主要阶段：精原细胞的有丝分裂，精母细胞减数分裂，精子减数分裂后期和精子的成熟期；即精原细胞的增殖、精母细胞的成熟分裂和精子细胞变态为精子三个主要过程[8]。在这三个阶段的生殖细胞分别被称为：精原细胞，精母细胞和精子细胞[2、7]。 由于在这些生殖细胞的发展阶段发生着巨大的生物学转变和细胞分化活动，精子发生相关的各种不同热休克蛋白也在其中参与这些生物学功能的调控[9]。
在老鼠、兔子和人类的研究已经发现，HSP70的不同异构体在精子发生的过程中具有时期特异性和发育相关性[5、7]。而且已经证实这些异构体在精子发生的生殖细胞分化过程中具有重要的调控作用。基因打靶实验证实中断老鼠HSP702基因的表达可以导致生殖细胞减数分裂停止，生殖细胞凋亡和雄性的不育症。此外，研究还证实HSP70还在人类、兔子、牛和其他一些水生生物精子发生受精过程和胚胎发育等过程中具有不可或缺的作用[1012]。更为重要的事，近年来一些热激蛋白基因和HSP70家族已经在两栖类Xenopus laevis，Pleurodeles waltl和Ambystoma mexicanum中鉴定出来，并证实HSP70蛋白家族参与了精子发生过程，卵子的发生，胚胎发育和细胞抗胁迫的应激过程。然而关于HSP70在长江刀鲚精子发生过程的作用机制还没有相关研究报道。因此，本篇文章主要围绕HSP70与刀鲚精子发生过程之间的关系展开。
刀鲚(Coilia ectenes)，又称长颌鲚，俗称刀鱼，隶属鲱形目(Clupeiformes)，鲱科(Clupeidae)，鲚属(Coilia)。我国长江中下游地区分布的的刀鲚最早是Jorden和Seale于1905年根据上海标本命名的一个物种。刀鲚是一种溯河洄游性鱼类，平时生活在中国、日本和朝鲜沿海，春季性成熟后从河口溯江而上进入江、湖中产卵繁殖，孵化后的幼鱼再返海肥育。约每年的2月中旬开始，亲鱼由海入江进行生殖洄游[13]。长江刀鲚资源调查协作组的调查指出，长江刀鲚的渔获量自1973年达最高值后开始下降，且种群的年龄、体长、体重等都有趋低的现象[14]。长江刀鲚雄性生殖生物学的研究仅仅局限于生殖系统的结构和精子的超微结构等方面的研究[15]。因此，深入研究长江刀鲚精子发生的分子机制，已经成为其生殖生物学研究的一个热点问题。本研究拟从长江刀鲚精巢中克隆HSP70基因；研究HSP70的组织表达分布和精巢中精子发生过程HSP70 mRNA的时空表达规律；探讨HSP70在长江刀鲚精子发生过程中的可能作用。
１ 材料与方法
１.1 实验材料及数据来源
于2013年4 月～7 月，在长江各江段段采集刀鲚，取刀鲚鱼体肝、肠、肌肉等组织。迅速取出各个组织，用DEPC处理水配制的磷酸缓冲液(phosphate buffer saline, PBS; pH 7.4)漂洗干净，迅速装入2.0 ml EP管中，立即投入液氮中并且贮存于80℃用于基因克隆和组织表达研究。

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