经克隆、测序获得了建鲤、黑龙江鲤、荷包红鲤、兴国红鲤、黄河鲤和框镜鲤6种43尾鲤鱼的mtDNA控制区全序列，并分析了控制区序列的变异和遗传多样性。结果显示6个鲤鱼群体的mtDNA 控制区序列全长为927-930 bp，A、T、C、G平均含量分别为33.4%、14.0%、32.9%和19.7%。6个鲤鱼群体43个体共检测到变异位点（S）为24个，都为简约信息位点；单倍型6种，单倍型多态性指数（h）为0.762；核苷酸多样性指数（pi）为0.0083，平均核苷酸差异数（K）为7.672。6个鲤鱼群体之间的遗传距离在0.0067-0.0112之间，平均0.0086。研究结果表明，6个鲤鱼群体D-loop区遗传多样性不够丰富，进化潜力有限。以线粒体DNA控制区全序列构建的UPGMA树揭示，6个鲤鱼群体未发生显著遗传分化各自构成单系。
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words 2
1 材料和方法3
1.1 实验材料 3
1.2 方法 3
1.2.1 基因组DNA提取3
1.2.2 PCR反应及测序3
1.2.3 数据分析3
2 结果4
2.1 线粒体DLoop区段扩增及测序结果4
2.2 遗传差异分析4
2.3 聚类分析4
3 讨论 7
3.1 Dloop 区序列碱基组成7
3.2遗传多样性及遗传变异7
致谢7
参考文献8
6种鲤鱼群体mtDNA Dloop区的遗传差异分析
引言
鲤(Cyprinus carpio )是我国养殖历史悠久、分布最广的重要淡水养殖鱼类，在淡水养殖业中鲤鱼养殖产量占相当大的比重。据农业部统计，2012年我国鲤鱼养殖总产量约290万吨，位居我国淡水养殖品种的前四位。我国鲤鱼养殖品种资源丰富，经全国水产原良种审定委员会审定和公布，适宜推广的优良养殖品种有40多个，如建鲤、福瑞鲤、松浦镜鲤、荷包红鲤、丰鲤、荷元鲤、三杂交鲤、颖鲤、岳鲤、芙蓉鲤、德国镜鲤等等。近年来我国鲤鱼品种种质资源混杂、退化严重，导致养殖经济性状下 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: *351916072* 
降，如生长缓慢，抗病力差等，对不同鲤鱼品种的遗传差异进行研究，将有利于其种质资源的遗传保护和合理利用，保持或进一步提高它们优良经济性状。
线粒体DNA控制区（mtDNA Dloop）是线粒体中碱基序列和长度变异最大的区域，具有进化速度最快，序列变异丰富等特点，适合于检测种群内及种群间的遗传多样性[1]和系统进化分析，是一种在分子水平上研究鱼类种群遗传多样性有效的手段[25]。建鲤(Cyprinus carpio var.jian)、黑龙江鲤(C.carpio haematopterus)、荷包红鲤(C.carpio var.wuyuanensis)、兴国红鲤(C.carpio var.singuonensis)、黄河鲤(C.carpio haematopterus Temminck et Schlegfl)和框镜鲤(Cyprinus carpio L)等都是我国优良的鲤鱼养殖品种，本实验克隆测定了这6种鲤鱼的线粒体DNA控制区核苷酸序列，并基于线粒体DNA控制区核苷酸序列分析这几种鲤鱼群体的遗传差异，为鲤鱼的遗传保护、持续利用和育种提供基础数据。
1 材料和方法
1.1 实验材料
实验样品均取自于中国水产科学研究院淡水渔业研究中心宜兴养殖基地。6种鲤鱼每种鲤鱼各取10尾，共60个样本。其中建鲤为淡水渔业研究中心选育保存品种，其他5种鲤鱼为原种地引进品种。剪取各品种样本的鳍条，用95%酒精保存备用。
1.2 方法
1.2.1 基因组DNA提取
样本鳍条经蛋白酶K消化后，用酚仿法抽提总DNA[6]，用0.8%的琼脂糖凝胶电泳测定DNA基因组的完整性，再用紫外分光光度计测定DNA样品的浓度和纯度，并稀释DNA至50100ng/μL，4 ℃保存备用。
1.2.2 PCR反应及测序
使用通用引物扩增DLoop区段基因，引物序列为：上游引物DL1:5 CTAACTCCCAAAGCTAGAATTCT 3，下游引物DL2: 5 ATCTTAGCATCTTCAGTG 3[7]扩增线粒体Dloop区全序列。PCR反应体系20μL：10×PCR反应缓冲液2.0 μL， MgC12(20 mmol/L)2 μL，dNTP(10mmol/L)0.4 μL，正、反向引物(20 μmol/L)各0.5μL，Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0.2μL，模板DNA(80100 ng/μL) 2.0 μL，ddH2O补足20.0 μL。PCR反应条件为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，35个循环；72℃延伸8 min；4 ℃保存。PCR产物用1.5 %琼脂糖凝胶电泳检测，并拍照记录。目标扩增产物回收纯化后，与pMD18T载体(Takara)连接，转化到大肠杆菌(E.coli) DH5α敏感态细胞中并在LB Amp+平板筛选阳性克隆，抽提质粒，EcoRⅠ、HindⅢ双酶切检测后，阳性克隆送至上海铂尚生物公司测序。
1.2.3 数据分析
序列用Clustal W（1.83）软件分析比对。利用DNASP（version 4.0）软件统计单倍型数（H）、单倍型多样性指数（h）、多态位点数（S）、核苷酸多样性（pi）及平均核苷酸差异数（K）。用MEGA 3.1中的Kimura双参数法计算个体间的遗传距离，根据遗传距离按非加权组对算数平均方差法(UPGMA)对不同鲤鱼群体建立聚类图。
2 结果
2.1线粒体DLoop区段扩增及测序结果
6种鲤鱼的DLoop区段PCR扩增电泳图谱如图1所示，DLoop 区PCR扩增长度在1100bp左右。目标扩增产物经回收纯化、克隆、测序，共得到43个样品的DLoop区序列，每种鲤鱼78个样品。测出的序列参照GenBank中已有的鲤鱼mtDNA D1oop区序列相比对，结果表明同源性都高达99%以上，确定所得序列为mtDNA D1oop区序列。去除多余碱基后，所测样品的DLoop区全序列核苷酸长度在927930 bp之间。6个群体DLoop区全序列的T、C、A、G碱基组成平均分别为33.4%、14.0%、32.9%、19.7%。其中，A和T碱基组成为66.3%，大于C+G的含量33.7%。

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