翘嘴鲌是重要的淡水经济鱼类之一，但因水环境污染、过度捕捞等因素导致翘嘴鲌的数量急剧减少，开展翘嘴鲌的遗传改良和育种工作可为其可持续渔业发展提供有效保障。本研究基于微卫星分子标记开发了3组4重PCR扩增体系，并对人工繁殖采集的36尾亲本以及其136尾子代进行亲子鉴定分析。基于36个候选亲本的等位基因频率分析，12个微卫星标记的等位基因数量范围介于7~22，观测杂合度介于0.39~0.75，期望杂合度介于0.57~0.91。所有微卫星位点呈现多态性（多态信息含量PIC > 0.5）。在亲子鉴定的分析中，135尾子代成功获得双亲鉴定（99.29%），且准确率为100%。简而言之，该研究开发了用于翘嘴鲌的微卫星多重PCR检测技术，可用于该物种的系谱构建，可作为该物种的家系选育的基础工具。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 实验材料 2
1.1.1 翘嘴鲌亲鱼培育 2
1.1.2 人工授精 3
1.1.3 收集子代样本 3
1.1.4 DNA提取 4
1.2 微卫星位点筛选和多重PCR体系构建4
1.3 数据统计分析5
2 结果与分析6
2.1 多重PCR体系构建6
2.2 翘嘴鲌基于3组微卫星四重PCR的亲子鉴定分析7
3 讨论9
4 结论10
致谢10
参考文献10
翘嘴鲌微卫星多重PCR体系及其亲子鉴定应用
引言
引言：翘嘴鲌(Culter alburnus Basilewsky)广泛分布于各大淡水水系中上层，又被称为大白鱼、翘壳、翘嘴巴等，体型较大，游泳速度快，善于跳跃，性情暴躁，喜欢捕食其他小鱼，也捕食昆虫、枝角类、桡足类等，幼鱼喜食藻类、昆虫。为凶猛性鱼类,在水生态系统的生态平衡中起着重要作用。翘嘴鲌少刺多肉，肉质细腻、味道鲜美，营养价值较高，被人们视为上等经济鱼类。因其具有较高的营养价值和经济价值而受到人们的关注[1]。东北兴凯湖产的大白鱼历来被列为中国淡水四大名鱼之一 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ￥351916072￥ 
，极具市场价值。此外，翘嘴鲌食性杂、生长快、易养殖，加之其人工养殖技术的推广普及，现在成为淡水渔业中发展前景较高的养殖品种。目前，在自然水体中，因为过度捕捞和水环境日益严重的污染等因素，导致了水体中的翘嘴鲌数量急剧减少。因此，当前对其开展品种选育，培育优秀种质是减少对其自然资源的依赖和破坏的有效手段。目前，针对翘嘴鲌的种质保护及遗传育种研究开展还较少，主要集中于远缘杂交[2]、群体遗传[3]及雌核发育[4]等方面研究。
人工选择是根据人们的需求，从混杂的群体中挑选符合要求的个体或类型进行培育的过程。人工选择分为两种：群体选育和家系选育，常运用于重要鱼类的遗传改良中。但是群体选育不能区分亲子关系，无法确定特定亲本在子代群体中的贡献率，下一代群体选择的个体容易来自于少量的亲本，导致有效繁殖亲本减少和高度近交现象。Brown等[5]对金头鲷（Sparus aurata）的研究发现，实际产卵的亲鱼数量只占使用亲本的1/3。有效降低近交率的条件是建立大量家系。但考虑到成本较高，实施难度较大，许多较小型研究所难以实现。大量研究证明使用高度多态性标记鉴定鱼类的出身的可行性[67]。针对某一种鱼通过混合产卵，可以借助物理标记和亲子鉴定技术来鉴别亲本与子代的关系，从而建立全同胞和半同胞家系。亲子鉴定方法有多种，目前应用最多的技术是DNA分子标记技术，原理是依据分子标记的孟德尔规律来判断个体间的亲子关系。微卫星标记作为分子标记具有分布广泛、多态性高、扩增效率高、检测容易及容易实现自动化标准等诸多优点。在鱼类育种中，基于微卫星标记的亲子鉴定方法在鉴别个体身份建立系谱信息方面是非常适用的[8]。目前，已经对鲢（Hypophthalmichthys molitrix）[9]、虹鳟（Oncorhynchus mykiss）[6]、金头鲷[10]、草鱼（Ctenopharyngodon idella）[11]、鲤（Cyprinus carpio）[12]、大西洋鲑（Salmo salar）[13]等重要经济鱼类都建立了微卫星标记的亲子鉴定方法。从这些建立的亲子鉴定体系可以看出，微卫星标记位点数从5到18不等，但是子代被正确判别的准确率很高（90.799.9%）。在翘嘴鲌的相关研究中，多态性微卫星标记的开发已有较多开展[1415]，而将其应用于家系构建及亲子鉴定等研究尚未见报道。因此，当前可以利用已开发的微卫星标记，针对繁殖过程中的亲本及子代开展亲子鉴定研究，探索人工繁育效率、亲子贡献率等翘嘴鲌繁殖生物学问题。
鱼类家系选育需要构建大量的家系，需要土池发塘来提供开口饵料，消耗大量的财力、物力、人力，育种实践中实施难度很大。如果采用群体选育，由于翘嘴鲌怀卵量较大，在选择过程中容易出现所选子代来自于少量的亲本，导致后期选育中发生高度近交。针对这些问题，本实验以多态性微卫星位点筛选，收集NCBI及研究团队前期开发的位点，基于12~24尾野生个体，筛选出多态性好、扩增效率高及存在扩增长度差异的微卫星位点，根据引物退火温度，片段大小，Mg2+浓度，引物连锁平衡关系等信息，筛选12~16个杂合度高的微卫星分子标记，采用荧光标记（FAM，HEX）引物，摸索构建多重PCR扩增体系，采用ABI3730测序仪STR分型技术获取基因型信息。根据对应的基因型频率，进行家系亲缘关系的重建模拟分析，通过模拟分析估计该方案鉴定能力。试验为翘嘴鲌家系选育过程中系谱关系的掌握和维系提供基础手段，并有助于了解翘嘴鲌繁殖生物学特征，以期准确掌握翘嘴鲌选育的家系数及选择效率，从而提高选育效率并加快选育进程。
1 材料与方法
1．1实验材料
1．1．1 翘嘴鲌亲鱼培育
在浙江省淡水水产研究所的养殖基地进行了翘嘴鲌的培育和繁殖。翘嘴鲌鱼是肉食性鱼类，在人工养殖前，应该进行人工驯化，喂食饲料的同时，前期应该注意少量多次喂食。喂食应做到四定，一是定时：一般在早上9点前喂食一次，下午4点前喂食一次。二是定点：在固定的位点喂食有助于观察翘嘴鲌进食情况，方便改进喂食方案。三是定质：投喂的饲料应该是新鲜的人工配合饲料，变质、腐败的饲料应及时清理。保证投喂的适口饲料营养均衡、新鲜不变质。四是定量：翘嘴鲌发育时期不同，为了使鱼体正常发育，所制定的饲料投喂方案应随之改变，不能使亲鱼时饱时饥。投喂饲料的量应根据季节温度、天气情况而改变。翘嘴鲌最佳摄食水温为18~30℃。一般7~9月是鱼体发育高峰期，应提供充足饵料，供其快速生长发育。但到了11月，温度降下来以后，鱼体代谢以及发育减缓，应逐渐减少投喂饵料的量。培养翘嘴鲌的水体应保持“肥、活、嫩、爽”，定时注水，定时用生石灰消毒以调节PH、净化水质、预防鱼病。在培育过程中，每日应定时查看翘嘴鲌浮头、吃食以及生长情况。

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