斑马鱼因其进行遗传操作方便这一突出优点已成为一种应用十分成熟的模式生物，在发育生物学和遗传学上的研究也具有一定基础。本研究应用动物组织提取基因组DNA，基因克隆，胚胎显微注射技术，序列比对等方法对斑马鱼的致突变序列的致变效应进行评价。从提取斑马鱼红体色突变体的DNA着手，扩增之后通过显微注射技术导入宿主受精卵细胞，获得很多红体色突变体，比对不同发育个体的序列差异，然后混合这些不同的序列，再次导入到宿主细胞中，发现具有致死效应，填补了该领域的一项空白。本实验可以更好的了解导入的基因序列调控斑马鱼发育的作用机制，为接下来研究做好铺垫。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.1.1主要试剂2
1.1.1主要仪器3
1.1.1实验动物3
1.2方法 3
1.2.1突变体基因组DNA提取3
1.2.2导入序列扩增3
1.2.3显微注射3
2结果与分析4
2.1显微注射结果 4
2.2进行序列比对，得到合意序列 5
2.3部分突变体 7
3讨论 7
致谢7
参考文献8斑马鱼致变序列致变效应的研究
引言
远缘物种基因组DNA导入会导致宿主产生突变，这是一个广泛报道的现象[1]。利用远缘物种创新种质是植物遗传育种的一个方向，中国有很多研究者通过这种方法育成了一些植物新品种[2]。在动物方面，鱼类也有此类报道，比如为了研究中国明对虾总DNA直接导入鲤鱼体内后，对鲤鱼肌肉成分的影响，研究人员依靠显微介导远缘杂交技术，将远缘基因导入到鲤鱼的受精卵，并获得了子代，对子代进行AFLP检测，发现均扩增出了供体基因片段[3]。还有研究人员从分子和基因水平上验证了河蟹总DNA可通过显微介导方式整合到镜鲤基因组[4]。这些都是对鱼类进行快速改良的有效手段。但是它们存在着一些问题，我们不知道宿主细胞是如何处理导入序列的以及哪些序列整合到宿主基因组中会导致突变，所以突变性状的重复性不高，甚至一些深入研究， *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ￥351916072$ 
使用全基因组测序也很难发现到底是哪些序列进入到了宿主基因组。
远缘DNA导入宿主会被降解还是重组主要看DNA序列上有什么元件，如果是质粒导入进去，它可以独立于宿主细胞核DNA表达，如果宿主基因组上有重组的位点，就会发生重组导入到宿主基因组中，如果单纯是一段DNA序列，无法独立复制或者整合到宿主基因组中，就很容易被降解。基于远缘物种基因组DNA导入会导致宿主产生突变这一现象，但同时远缘DNA序列进入宿主细胞大部分都会被降解。本实验将采用一种新思路，那就是完全摒弃远缘DNA。科研人员曾经直接将鲤鱼基因组DNA经过改造，导入鲤鱼受精卵，发现可以导致鲤鱼产生突变体[5,6]。但是该方法仍然有很大的缺陷，而且对于其他鱼类是否也会产生此现象并没有把握，所以进一步改良了该方法。并利用斑马鱼作为研究对象进行了研究，发现该方法完全适用于斑马鱼。我们从37条成活斑马鱼个体中得到红体色突变体一个，经克隆得到一条导入序列，导入该序列可以重复该突变。我们在突变后代中得到一系列和该序列有差异的序列。本实验的目的就是验证这些序列的突变效果。
斑马鱼(Danio Rerio)是生活在印度、巴基斯坦或其他亚洲国家河流中的一种淡水鱼，野生的斑马鱼来自喜马拉雅水域。在胚胎发育、细胞迁移、器官发生、行为学以及睡眠研究等领域应用广泛，为生物和医学研究做出了巨大的贡献[7]。能够高密度生长，花费较低，易于饲养，繁殖能力强，发育速度快，易于进行遗传筛选以及透明的胚胎，是斑马鱼成为发育生物学家们最喜欢生物模型的几个条件。另外，斑马鱼胚胎易于物理和基因操作，便于研究人员分解，控制发育过程的信号。
目前研究中常用的斑马鱼野生型品系主要为AB品系、Tuebingen（Tu）品系、WIK品系，斑马鱼基因组计划所用品系是Tu。AB品系是实验室常用的斑马鱼品系，由单倍体细胞经早期加压法获得[8]。Tu品系斑马鱼具有胚胎致死突变基因，用于基因组测序前敲除该致死突变基因。WIK品系较Tu品系具有更多的形态多样性。此外，还保存有3000多个突变品系和100多个转基因品系。这些品系资源对于利用斑马鱼开展各种科学研究起着很大的推动作用。插入诱变是斑马鱼突变的方法之一，它是以逆转录病毒为载体，用显微注射法将目的基因片段导入斑马鱼受精卵，整合到基因组中，干扰正常基因表达。
斑马鱼作为一种最佳动物模型已成为生物研究的新动向。本研究从斑马鱼突变个体中提取基因组DNA，经过克隆得到导入序列，易在斑马鱼受精卵中表达。本研究为斑马鱼致变序列的致变效应试验提供研究基础，为鱼类的育种和斑马鱼在发育生物学上应用提供更多思路及研究基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂 STE裂解缓冲液， RNase A，苯酚:氯仿(1:1)溶液，无水乙醇，75%乙醇，超纯水，引物 Gmprimer2（5 μM，ccaaacacatgaagccgaatt），2×MasterMix（诺唯赞公司），AXYGEN 公司的PCR clean up试剂盒
1.1.2 主要仪器 涡轮震荡器，离心机，无核酸酶EP管，显微注射器（可以调节气压脉冲，注入精确的体积），立体显微镜（能够在显微注射过程中看到胚胎并对注射针所在的位置聚焦），持针器（通常装在显微注射器上），显微操作器，胶头滴管，胶固定板，孵化箱
1.1.3 实验动物 饲养在特殊水箱中3个月大的斑马鱼。自来水对于斑马鱼来说是有毒的，因为其中存在氯和潜在的污染物，所以水要经过纯化。其饲养水质环境为自来水通过过滤系统进行纯化，在纯化水中添加盐分和PH缓冲液来优化其盐度和酸碱度。温度保持在28℃。为了保持其生物节律，光周期保持14小时光照和10小时黑暗。

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