环境DNA（Environmental DNA, eDNA）技术是通过收集、分离和分析环境样品中的DNA来检测物种是否存在，是一种低耗、高效、高灵敏度的无损伤性物种监测新技术。本实验致力于探索一种基于水环境 DNA 的无损伤的鱼类组成分析方法，旨在了解安庆西江长江江豚迁地保护基地鱼类组成现状，为长江江豚生存环境保护提供基础数据。通过提取水样环境DNA，采用鱼类通用引物进行PCR扩增，根据调查的鱼类数据建立数据库，将Illumina MiSeq高通量测序结果与数据库进行比对，获得的序列分析结果显示共检测出鳙、草鱼、鲢、鲫、鲤、麦穗鱼、黄颡鱼、翘嘴鲌等10种鱼类。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1引言1
1材料与方法3
1.1水样采集3
1.2主要仪器3
1.3主要试剂4
1.4实验方法4
1.4.1水样eDNA提取4
1.4.2水样eDNA PCR扩增5
1.4.3Illumina MiSeq测序5
1.4.4序列分析6
2结果与分析6
2.1水样DNA提取结果6
2.2水样DNA PCR扩增结果6
2.3利用调查鱼类数据建立数据库6
2.4Illumina MiSeq测序结果6
3讨论7
3.1环境DNA的检出 7
3.2鱼类物种的检测8
3.3环境DNA应用前景8
致谢8
参考文献9
附录1 西江鱼类名录10
附录2 鱼类Cytb基因库12
利用环境DNA技术监测验证安庆西江长江江豚迁地保护基地鱼类组成
引言
引言
长江江豚是世界上目前唯一已知的淡水亚种，是我国特有的相对独立的淡水江豚种群[13]，主要分布在长江中下游干流和与长江相连的大型湖泊如洞庭湖和鄱阳湖[46]。江豚和白鳍豚一样，位于水生生态系统“金字塔”的顶端，关系到长江生态系统是否处于健康状态的重要指示物种。在2007年白鱀豚被宣告功能性灭绝后，长 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ^351916072* 
江江豚成为长江中栖息的唯一鲸类动物[7]。20世纪80年代至今，长江中下游干流江豚的分布范围呈萎缩趋势，分布特征呈现为相对集中、日益斑块化，各群体之间的距离渐趋扩大。近年来，由于长江流域过度的捕捞，航运事业的快速发展，长江大型水利工程的建设，水质污染等种种原因[8]，使得江豚赖以生存的环境受到波坏，江豚的数量也急速下降[9]。若是不采取各种有效措施，江豚将像白鳍豚那样面对种族灭绝的危机。目前，长江江豚已经被我国列为一级保护动物[10]，2013年世界自然保护联盟（IUCN）也将江豚列入濒危物种赤色名录中的“极度濒危”[11]。在长江江豚自然栖息环境短时间内不能有效改善的情况下，长江江豚的保护工作已进入了最后的“保种”阶段。由于长江生态环境的转变，江豚在原地保护难以维持的情况下，从长远来看，最有效的措施之一就是进行迁地保护。目前在长江江豚的分布区已经建成了3个长江江豚迁地保护区(湖北长江天鹅洲白鱀豚国家级自然保护区、湖北何王庙/湖南集成垸长江江豚迁地保护区和安徽安庆西江长江江豚迁地保护基地)。西江系长江故道，长约10公里、宽200到500米、水深5到20米、水域面积6000多亩，汛期下游与长江相通，饵料丰腴、水质优良，是目前长江安庆段自然环境最好、人类活动干扰最小、最适合进行江豚保护的水域。
近年来水生生物成为生物多样性保护的重要内容，是全球生物多样性的重要组成内容[12]。然而，相较于陆生动物，由于水生生物相对落后的调查方法，使得很多水生物种基础的生物学信息不完整，如种群分布的范围、种群的大小和动态等[13]，信息的不完整阻碍了水生生物保护生物学研究的进行，因此我们亟需一种新的种群资源调查的方法。把握物种种群的分布区域和数量大小，对于物种和生物多样性保护来说是很重要的内容。传统的水生生物调查方法，主要是现场调查法如直接捕捞，这种方法费时费力，而且可能会伤害到目标物种或者破坏了调差地点的生态环境[14,15]。随着分子生物学的发展，尤其是DNA分析技术的问世，一种新的水生生物的监测技术—环境DNA分析技术应运而生[13]。
环境DNA（environmental DNA，eDNA）是指从环境样本中提取的DNA，生物体通过分泌物、粪便、血液、组织器官坏死等各种途径将DNA释放到环境中[16]。从环境样本中提取环境DNA，然后在通过特定的DNA分子标记检测样本中特定种属的物种[17]。环境DNA技术就是通过提取环境样本中的基因组DNA，通过特定引物进行PCR扩增，对序列结果进行DNA测序分析（如Sanger双脱氧链终止法；化学裂解法；新一代测序技术(NGS)等），从而获得目标物种的定量或者定性的结果，分析出目标物种在相关生态系统中的分布和特征[18]。因此，通过利用环境DNA技术，尝试建立利用eDNA无损分析鱼类组成的方法，从而为保护江豚保护区提供相应的数据支撑。
最早对eDNA进行研究的是微生物学家Ogram，1987年他成功的从湖底沉积物中提取出微生物的DNA[19]。从2000年开始，eDNA的概念开始被广泛接受，Rondon[20]等运用eDNA分析技术来检测微生物多样性及物种鉴定。2008年，Ficetola 等首次将水样eDNA分析应用于水生生物研究领域[21]。随着现代分子生物学技术的快速发展，DNA检测的手段和分析技术也日益多样化。
本实验建立了“水体样本采集水样过滤环境总DNA提取PCR扩增高通量测序数据处理和鱼类物种组成分析”的实验流程。通过对水体中环境DNA的定性检测实现对保护基地内鱼类物种组成的监测。并结合传统的鱼类组成调查方法，可以更加准确的掌握西江水域的鱼类物种组成，为评估迁地保护基地内长江江豚的生存环境提供了一种新的技术。

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