本研究在获得克氏原螯虾发病组织样本高通量测序若干片段的基础上，设计了一对内引物和一对引物，并进行巢式RT-PCR,在健康虾的肝胰腺中鉴定出一种新的病毒，暂将其命名为pcpv3(Procambarus clarkii picorna-like virus Ⅲ)。利用分子克隆和桑格测序技术获得了其部分全长序列，并进一步通过生物信息学手段对该病毒的基因序列进行了分析，结果表明该病毒与双顺反子病毒科的蟋蟀痹病毒（Cricket paralysis virus，CrPV）较为接近，保守区域RNA依赖性RNA聚合酶的氨基酸同源相似性为94，初步判断该病毒在分类学上属于小RNA病毒目的双顺反子病毒科。（200—300字，五号宋体）
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1□材料与方法Y
1.1□材料 Y
1.2□方法 Y
1.2.1□×××××Y
1.2.2□×××××Y
1.2.3□×××××Y
1.2.4□×××××Y
2□××Y
2.1□×××××Y
3□××× Y
（略）
X ×××××（正文第X章）Y
致谢Y
参考文献Y
附录A ××××（必要时）Y
附录B ××××（必要时）Y
图1 ××××（必要时）Y
图2 ××××（必要时）Y
表1 ××××（必要时）Y
表2 ××××（必要时）Y
注：1. 目次中的内容一般列出“章”、“节”、“条”三级标题即可；
2．X、Y表示具体的阿拉伯数字；
克氏原螯虾小RNA样病毒的鉴定及其序列分析
引言
引言
克氏原螯虾（Procambarus clarkii）又名美国螯虾、路易斯安那州螯虾，我国大陆地区称小龙虾。在动物分类学上，克氏原螯虾是隶属于节肢动物门( Arthropoda)甲壳纲（Crustacea）十足目（Decapoda）刺蛄科（ *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: #351916072# 
Astacidae）原螯虾属（Procambarus）的淡水虾类。克氏原螯虾原产地为美国南部和墨西哥东北部，20世纪20年代传入日本，1929 年由日本引入我国， 半个多世纪以来，其自然种群发展很快，已广泛分布于我国大部分省市，特别是在长江中下游地区已成为优势种群[1]。又因其具有高蛋白、低脂肪，营养丰富且风味鲜美等优良特点，越来越受到消费者的喜爱，近年来已逐渐成为水产养殖业中的重要品种。伴随着克氏原螯虾人工养殖业的发展，出现了稻田养殖、大棚养殖、工厂化养殖等高效养殖，提高了克氏原螯虾的养殖规模和产量。然而病害的时有发生严重制约了克氏原螯虾养殖产业的进一步发展，其中，病毒病又是对克氏原螯虾养殖造成的主要威胁之一。近年来，我国克氏原螯虾主产区不断有白斑综合征病害爆发的报道[24]。
尽管对于克氏原螯虾养殖中的白斑综合征和白斑综合征病毒( white spot syndrome virus,WSSV)的报道和研究已经比较深入，但是总体来说，有关淡水螯虾病毒性疾病尤其是RNA病毒疾病的研究现在积累的知识还是非常有限的, 对淡水螯虾病毒性疾病的实验研究也还只是最近十来年才逐渐展开的，许多病害的发病原因和作用机制仍然是模糊不清的。已有一些研究结果证明,克氏原螯虾体内病毒一般处于潜伏感染状态, 其体内存在的多种病毒即使在寄主中出现, 其症状也并不明显 ,甚至没有组织学方面的病变迹象。然而 ,一旦温度、水质等水体环境急剧变化或适宜病毒繁殖, 寄主暴发性死亡的可能性就会大大增加[56]，因此，对于克氏原螯虾体内潜伏病毒的研究是十分重要的。
小RNA病毒目(Picornavirales)是一类直径约30纳米的无囊膜二十面体对称的单链或双链正链RNA颗粒病毒，该病毒超家族中已归类的病毒主要包含有五个科：小RNA病毒科（Picornaviridae），双顺反子病毒科（Dicistroviridae），Iflaviridae科, Secoviridae科，Marnaviridae科。遗传物质除Secoviridae科病毒由两条5800到8400nt和3200到7300nts长的双链核酸组成外，其余病毒多为长度在700012500nt之间的单链RNA。其中，小RNA病毒科的病毒主要感染脊椎动物，Secoviridae科的病毒主要感染植物，双顺反子科病毒和Iflaviridae科的病毒主要感染无脊椎动物，而Marnaviridae科病毒主要感染藻类[7]。
本研究在获得了克氏原螯虾发病组织样本的高通量测序片段的基础上，设计特异性引物，利用巢式RTPCR技术对类小RNA病毒进行鉴定，并通过分子克隆补齐测序片段，利用生物信息学的手段对所得序列进行分类和分析，以探讨该病毒分类学地位并尝试推测其潜在的致病性，从而为生产实践中的虾蟹病害预防、鉴定和诊断提供一定的理论参考。
1 材料与方法
1．1 样本采集
本实验所用的克氏原螯虾均购自无锡市滨湖区雪浪街道农贸市场，分批随机购买30只不同规格和来源的虾。依次取肝脏样本约0.05g于RNaseFree离心管中，剩余组织密封编号置于80℃冰箱中备用，每次检测十个样本。
1．2 总RNA提取
根据试剂生产商提供的说明书，向装有新鲜肝脏的离心管中立即加入1mL RNAiso Plus(购自北京康为世纪生物科技有限公司)和两粒经高温高压灭菌的石英小磁珠，匀浆机设置60Hz旋涡振荡200s，室温静置5min，冷冻离心机设置4℃12000r/min离心5min，取上清液600μL于新的RNaseFree离心管中，加200μL氯仿剧烈摇动15s后室温静置3min, 4℃12000r/min冷冻离心15min，取上清水相于新的RNaseFree离心管中，加500μL异丙醇混匀，室温静置10min，4℃12000r/min冷冻离心10min，去除上清液，用体积分数为75％的乙醇洗涤沉淀2次，室温干燥去除残留乙醇留下RNA颗粒，加入30μL DEPC溶解。通过核酸定量仪测定OD260nm/OD280nm,确保RNA浓度和纯度,用10g/L琼脂糖凝胶电泳检测浓度及完整性。

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