河蟹（Eriocheir sinensis）是中国水产养殖业主要的淡水甲壳类经济动物，已广泛养殖超过30年。然而，随着人工养殖规模的不断扩大，病害频繁发生，对生产造成严重的影响。 布尼亚病毒科是媒传疾病中重要的病毒科之一，该病毒科主要通过节肢动物和啮齿动物传媒，宿主有哺乳动物和人类。有研究表明布尼亚病毒和河蟹颤抖病存在一定联系，国内外关于蟹类病毒病的研究也有较多的报道,引起蟹类疾病的病毒有杆状病毒样病毒（White spot syndrome virus, WSSV）、呼肠孤病毒样病毒(Reovirus-like Virus) 、布尼亚病毒样病毒、细小病毒样病毒以及轮状病毒等。 “颤抖病”也叫“抖抖病”，1994年首次在江苏省发现,颤抖病症状主要表现出腹肢颤抖和卷曲，行动迟缓，食欲不振。 我们课题组从患颤抖病的河蟹体内分离纯化了一株河蟹布尼亚病毒，通过人工感染实验得出，该病毒对河蟹有较高的致死率，但感染死亡的河蟹无颤抖症状，该病毒可能不是颤抖病的主要病原。但河蟹布尼亚病毒和颤抖病存在怎样的关系，需要通过对该病毒基因特性和病毒结构作进一步的研究。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 2
1材料与方法 3
1.1实验材料与仪器 3
1.2实验药品及试剂 3
1.3核酸提取 4
1.4检测方法 4
1.5 病毒的分离纯化 4
1.6 病毒核酸电泳分析 4
1.7 人工感染试验 5
2 结果与分析 5
2.1 病蟹筛选 5
2.2病毒分离纯化结果分析 5
2.3 病毒核酸特性 6
2.4 人工感染试验 6
2.5 EsBV和EsRV两种病毒阳性检出比率 7
3 结论 8
致谢 8
参考文献 9
中华绒螯蟹布尼亚病毒的分离研究
引言
河蟹，又名大闸蟹，学名中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）隶属于节肢动物门(Arthropoda)、甲壳纲（Crust *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ￥351916072$ 
acea）、十足目（Decapoda）、方蟹科(Grapsidae)、绒螯蟹属（Eriocheir），广泛分布于我国沿海诸省各大水系[12]。二十世纪九十年代以来，养殖面积逐年增长，遍及江苏、浙江、湖北、河北以及安徽等主要淡水养殖省份[1]。
河蟹颤抖病，又称河蟹抖抖病、河蟹环爪病，为我国水生动物三类疫病之一[3]。该病于1994年在江苏省发现，随后传播至安徽、浙江、湖北等主要中华绒螯蟹养殖地[1]。发病初期，病蟹主要临床症状表现为反应迟钝、行动迟缓，摄食量骤减，甚至完全停止摄食，随着病情的发展病蟹出现肌肉萎缩、鳃丝肿大、呈浅棕色、少数甚至呈黑色，血淋巴液稀薄、凝固缓慢或不凝固，最典型的症状为步足颤抖、环爪、爪尖着地、腹部离开地面，甚至蟹体倒立[3,4]。河蟹颤抖病出现已超过二十年，但有关河蟹颤抖病病原的研究一直没有权威的结论。针对这种危害极大的河蟹疫病, 许多专家展开了河蟹颤抖病病因 的研究, 揭示了致病的病原体是由病毒、类立克次体、细菌等病原微生物引起, 或由病毒和细菌共同引起, 此外也还有报道可能是中毒引起等等。虽然这些结论不够一致,有些结果还需要进一步深入研究, 但这些报道对进一步深入研究河蟹颤抖病的发病原因、病理机制、流行规律及防治都具有很好的参考价值。目前，学术界对颤抖病的病原及致病机理的主流报道有两种：细菌说［169］和病毒说。此外也有类立克次体、环境和多病原等说法。国内外关于蟹类病毒病的研究也有较多的报道［59］。引起蟹类疾病的病毒有杆状病毒样病毒（White spot syndrome virus, WSSV）,呼肠孤病毒样病毒(Reoviruslike Virus)，河蟹布尼亚样病毒(Bynyalike virus )［10］，细小病毒样病毒以及轮状病毒等[1418]。
布尼亚病毒（Bunia virus）是一种新的病毒，1943年在非洲乌干达西部布尼亚姆韦拉地区研究黄热病时发现的。在接下来的十年中，进一步的病毒发现和详细的血清学研究以及生物化学和形态学分析，导致了由可以通过可重复的血清学交叉反应相关联的病毒组组成的布尼亚病毒超群的概念。进一步为这些病毒定义了血清群（通过其在任何血清学检测中的反应性相关的病毒）和复合物（血清群的密切相关的成员）。1975年国际病毒分类委员会将这一类病毒统一归入同一病毒科，并命名为布尼亚病毒科（Bunyaviridae）。它与黄病毒科（Flaviviridae）、披膜病毒科（Togaviridae）并称为媒传疾病中的3大病毒科［11］。病毒颗粒直径为80至120nm，显示5至10nm的表面糖蛋白（GP）投影，其嵌入脂质双层包膜中约5至7nm厚。虽然也可以看到通常为球形的细长形式，特别是汉坦病毒。邻苯二甲病毒，拉克罗斯病毒（LACV）的电子显微镜和生物化学研究表明，每个病毒粒子有270至1400 GP峰值。峰值被认为主要由两种病毒性GPs的异源二聚体组成。 GPs相互作用以形成在不同属中的病毒之间变化的表面形态单位。飞行病毒属中的病毒具有圆形紧密堆积的形态单位，直径约10至11nm，中心腔直径约5nm。戊二醛固定颗粒的负染色以及冷冻蚀刻技术证明了UUKV的表面单元是排列在T = 12，P = 3二十面体表面晶格中的五邻体 六邻体，六邻体距离估计为12.5〜染色的病毒颗粒为16nm，冷冻蚀刻样品为17nm。汉坦病毒属病毒的表面结构也是明确排列的，并且具有方形网格状外观。相比之下，Orthobunyavirus属中的病毒粒子具有被紧密堆积的，具有旋转形状的单元覆盖的表面，没有可检测的顺序。类似地，在奈威病毒属的病毒上观察到具有中心腔的小表面结构没有发现明显的顺序。病毒在Tospovirus属中的出现已被比作奈维克病毒。 除了在阴性染色的病毒粒子上作为边缘观察到的GP投影的存在之外，这些病毒还没有注意到独特的表面结构。通过薄截面电子显微镜观察到的病毒粒子的内部具有丝状或卷曲的珠粒外观，可能是由于存在核糖核酸。布尼亚病毒分布很广泛，该病毒科可广泛传播包括节肢动物、植物和哺乳动物。病毒粒子的组成和结构已经从生化和形态学研究中得到推断。 估计UUKV的2％RNA，58％蛋白质，33％脂质和7％碳水化合物的总体化学成分。 病毒粒子的沉降系数在400〜500S之间，蔗糖的浮力密度为1.16〜1.18g / cm3，CsCl为1.20〜1.21g / cm3。 用脂质溶剂或非离子洗涤剂进行处理可消除病毒包膜，导致节肢动物和哺乳动物丧失传染性。 对于植物而言，如TSWV的研究所证明的，对于感染性而言，信封不是必需的，因为在植物中反复机械通过导致不能产生包膜颗粒但能够在植物细胞中复制的缺陷病毒。

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