探究外源短期添加17β-雌二醇（17β-E2）对蚂蟥性腺发育相关基因表达的影响。越冬前6周选取体重约6.0 g健康蚂蟥，使养殖水体中17β-E2的浓度分别为0.0、1.0、10.0、25.0、50.0、100.0 ng·mL-1，养殖6周后停止添加，自然越冬60 d后测定蚂蟥性腺发育相关基因表达水平。结果表明蚂蟥性腺中GH、IGF-1基因表达水平随着外源17β-E2浓度的升高呈现先升高后降低的趋势，其中25.0 ng·mL-1组显著高于其余各组（P<0.05）；WNT4、FOXL2基因在雄性腺中随外源17β-E2浓度的升高呈先升高后降低的趋势，当外源17β-E2浓度>25.0 ng·mL-1时，WNT4、FOXL2的表达量显著低于对照组（P<0.05），WNT4、FOXL2基因在雌性腺中随外源17β-E2浓度的升高呈先升高后降低的趋势，且均显著高于对照组（P<0.05），其中25.0 ng·mL-1时FOXL2基因表达量最高，50.0 ng·mL-1时WNT4基因表达量最高；随外源17β-E2浓度的升高雄性腺中SRY基因水平呈先升高后降低的趋势，大于10.0 ng·mL-1时显著低于对照组（P<0.05），雌性腺中SRY基因水平表现为逐渐降低的趋势；随外源17β-E2浓度的升高性腺中17β-羟基类固醇脱氢酶基因在雌雄性腺的表达水平先升高后降低，且均显著高于对照组（P<0.05）；蚂蟥性腺中芳香化酶基因CYP19α随外源17β-E2浓度的升高呈先升高后降低趋势，其中雌性腺中的表达水平均高于对照组（P<0.05），雄性腺中浓度大于25.0 ng·mL-1时显著低于对照组（P<0.05）。综上，外源17β-E2通过促进蚂蟥GH、IGF-1、WNT4、FOXL2、CYP19α、17β-HSD基因的表达，抑制SRY基因表达，促进蚂蟥生长和雌性腺发育、抑制雄性腺发育。
目录
摘要 3
关键词 3
Abstract 3
Key words 3
引言 4
1 材料与方法 4
1.1 材料 4
1.1.1 实验动物 4
1.1.2 实验仪器 4
1.1.3 实验试剂 5
1.2 方法 5
1.2.1 实验设计 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ^351916072# 
5
1.2.2 引物设计 5
1.2.3 蚂蟥性腺总RNA提取 5
1.2.4 去除基因组DNA和cDNA的合成 6
1.2.5 PCR检测引物 6
1.2.6 Realtime PCR测定蚂蟥性腺发育相关基因表达量 6
1.2.7 统计分析 7
2 结果与分析 7
2.1 外源17βE2对蚂蟥GH、IGF1基因相对表达量的影响 7
2.2 外源17βE2对蚂蟥雌性性腺发育WNT4、FOXL2基因表达的影响 7
2.3 外源17βE2对蚂蟥雄性性腺发育SRY基因表达的影响 8
2.4 外源17βE2对蚂蟥性腺发育相关酶CYP19α、17βHSD基因表达的影响 8
3 讨论 9
3.1 外源雌二醇对蚂蟥雌雄性腺发育相关基因表达的影响 9
3.2 外源雌二醇对蚂蟥生长相关基因表达的影响 10
3.3 外源雌二醇对蚂蟥性腺发育相关酶基因表达的影响 10
4 小结 11
致谢 11
参考文献 12
短期添加17β雌二醇对越冬蚂蟥性腺发育相关基因表达的影响
引言
蚂蟥Whitmania pigra Whitman，又称宽体金线蛭，是药材水蛭的主要基原动物之一，收录于2015版《中国药典》[1],具有良好的破血通经，逐瘀消癥功效，在治疗高血压、经闭，防治心脑血管疾病和抗癌方面有特效[2]。近年来，由于中药材水蛭的市场需求上涨，同时环境污染日益严重，导致蚂蟥等基原动物濒临灭绝，供需矛盾突出，人工养殖受到极大关注。大学中药材研究所蚂蟥实验室通过对蚂蟥的摄食规律、消化系统、呼吸规律以及密度养殖等方面的内容[38]，蚂蟥的人工养殖已取得了阶段性的成功并进行了一定规模的推广，但在实际生产中仍存在尚未解决的养殖难点和关键问题。在生物学研究方面，主要集中在对蚂蟥呼吸生理[10]、消化生理、组织结构[11]、遗传多样性[9]、内在品质[1213]。研究发现蚂蟥为同步性雌雄同体动物，同时具备雌雄性腺，自然条件下，雄性腺先于雌性腺发育，待越冬结束逐渐共同成熟[30]。类固醇激素影响动物性腺发育，其中雌雄激素与生殖细胞的发育直接相关[29]，研究表明性腺发育不仅与体内性类固醇激素以及遗传因素有密切关系，同时也会受到外源因子（温度、激素等）的影响[31]。研究表明，外源雌激素能促进中华鳖卵巢的发育[18]、诱导小黄鱼雌性化[15]、使半滑舌鳎卵巢分化提前约5d[16]。本实验课题组前期研究结果表明，在蚂蟥越冬前102天在养殖水体中添加17βE2，养殖6周后停止添加，让蚂蟥自然冬眠60天后，发现1.0100.0 ngmL1外源17βE2对蚂蟥生长和性腺发育以及内源类固醇激素水平具有明显的影响作用，其中10~25 ngmL1外源17βE2，在不抑制雄性性腺发育的同时能促进越冬蚂蟥生长、卵细胞发育、提高抗凝血酶活性。本实验拟在此基础上进一步研究短期添加外源雌激素对越冬蚂蟥性腺发育相关基因表达的影响，为进一步研究蚂蟥性腺发育的分子机理提供理论基础和科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物
实验用蚂蟥由大学中药材研究所蚂蟥实验室提供，经郭巧生教授鉴定为蚂蟥Whitmania pigra Whitman；实验所用饵料螺蛳（采自南京玄武湖，野生）为梨形环棱螺Bellamya purificata Heude。
1.1.2 实验仪器
超低温冰箱（海尔）、制冰机（上海亿倍实验有限公司）、超净工作台（苏州苏洁净化设备有限公司）、电子天平（山东精密仪器厂）、FA1104分析天平（上海精科天平）、5810R离心机（Eppendorf）、HHS型水浴锅（巩义市予华仪器有限责任公司）、KQ250B超声仪（昆山市超声仪器公司）、Nano300超微量分光光度计（杭州奥盛仪器有限公司）、凝胶成像仪（JS380，上海培清科技有限公司）、PTC200双孔PCR仪（Alpha）、荧光定量PCR仪（ABI STEPONE）等。
1.1.3 实验试剂
TRIzol试剂（大连宝生株式会社）、Takara试剂盒（Prime ScriptTM RT Kit with gDNA Eraser）、实验用17β雌二醇为分析纯，购自上海源叶生物科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1 实验设计
选取5.5月龄体重6.0 g左右的健康蚂蟥，设置水体17β雌二醇浓度为1.0、10.0、25.0、50.0、100.0 ngmL1 5个浓度组和一个空白对照组，分别标记为C1、C2、C3、C4、C5组和CK组。每组24瓶，每瓶10条蚂蟥。其它养殖管理条件相同，实验处理6周后，自然冬眠60d，检测各组蚂蟥雌雄性腺中GH、IGF1、SRY、WNT4、FOXL2、CYP19α、17βHSD的表达量。

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