以前期获得的过表达玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ZmPEPC大豆T4代植株为研究对象，分析过表达ZmPEPC基因对大豆耐旱性的影响。结果表明，利用草丁膦涂抹筛选鉴定得到4个T4代转基因阳性大豆株系，其体内ZmPEPC基因表达量存在差异。此外，过表达ZmPEPC提高了大豆叶片的光合效率。选取过表达ZmPEPC株系（#5）和对照受体大豆品种Jack 紫在苗期通过停止浇水进行干旱胁迫处理。结果发现，干旱胁迫下过表达ZmPEPC基因提高了大豆植株的存活率和叶片相对含水量，表明过表达ZmPEPC基因提高了大豆的耐旱性。
目录
摘要 2
关键字 2
Abstract 2
keywords 2
引言 2
1 材料与方法 4
1.1 材料及处理 4
1.2 研究方法 4
1.2.1 转基因阳性苗鉴定及外部形态观察 4
1.2.2 过表达ZmPEPC植株的半定量PCR 4
1.2.3 过表达ZmPEPC基因植株的光合效率测定 4
1.2.4 过表达ZmPEPC基因植株叶片相对含水量测定 4
2 结果与分析 5
2.1 过表达ZmPEPC基因转基因大豆植株的筛选和鉴定 5
2.2 过表达ZmPEPC和对照大豆植株的叶片光合效率测定 5
2.3 干旱胁迫下过表达ZmPEPC基因转基因大豆的表型分析 6
2.4 过表达ZmPEPC和对照大豆植株叶片相对含水量测定 6
3 讨论 7
致谢 7
参考文献 8
过表达玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（ZmPEPC）对大豆耐旱性的影响
引言
引言
大豆是世界五大经济作物之一，也是优质蛋白质和食用油脂的重要来源。大豆含有人体必需的8种氨基酸以及多种矿质营养元素和生理活性物质[1]；并且，大豆的次生代谢物具有降低胆固醇、预防心脏病和乳腺癌等的作用[2]。此外，在生产上大豆属于耕地用养结合性作物，具有生产投入少、比较效益高等优点。因此，大豆在农业生产中占有重要的地位。
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水量大，但是根系不发达，在豆类作物中对缺水最为敏感，水分亏缺是大豆产量提高和品质提升的瓶颈[3]。在全球范围内，干旱和半干旱地区总面积占全部陆地面积的34.9%，遍及多个国家和地区；我国也有很大面积的干旱和半干旱土地[4]。大豆在中国主要分为3个产区，3个大豆产区在大豆生长期间均会遭遇不同程度的干旱。例如，北方春豆常遇春旱，黄淮海地区常遇伏旱，南方地区常遇伏旱和秋旱[5]。我国每年因干旱对大豆产量和品质造成的损失较为严重。因此，提高大豆的抗旱性，对我国农业生产和粮食安全具有重要的意义。
干旱胁迫对大豆的伤害主要分为以下方面[6]：（1）破坏正常代谢。在细胞脱水条件下，植物会抑制合成代谢，而促进分解代谢，主要是因为水分亏缺使气孔关闭，CO2扩散过程受阻，从而使光合作用下降；并且严重的水分胁迫会破坏光系统II，电子传递和光合磷酸化受抑制，导致光合作用下降。同时，水解酶类活性增加且蛋白合成酶类活性降低，使得呼吸作用增强，蛋白质分解，脯氨酸积累。（2）改变细胞膜结构及透性。在干旱条件下，细胞失水到一定程度时，膜上磷脂双分子层排列紊乱使得膜上出现孔隙,膜蛋白被破坏，导致膜选择透性丧失。（3）机械损伤。当细胞失水或吸水时，原生质体和细胞壁会共同收缩或膨胀，但它们的弹性并不一致；当失水到一定限度时，细胞壁不再随原生质体收缩，使得原生质体破裂。此外，脱水后复原的细胞如果骤然大量吸水会导致细胞壁膨胀速度远大于原生质体，同样使原生质体收到破坏。
已有研究[7]表明，在干旱时，植物若能保持旺盛的光合作用能力，会大大提高其抗旱性；而高等植物按照不同的碳同化途径，分为C3、C4和CAM植物[8]，由于C4和CAM植物具有高光效基因，使其在高温、高光照、高氧分压条件下具有比植物更高的光合作用效率。C4植物中最初固定CO2的酶为磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)，与C3作物中的1,5二磷酸核酮糖羧化酶（Rubisco）相比，PEPC对CO2的亲和力更高，并且先在叶肉细胞内催化形成草酰乙酸和苹果酸，然后再转移至维管束鞘细胞进行脱羧和Rubisco的CO2固定。此外，C4植物的叶肉细胞“花环”结构相当于一个CO2泵，使得CO2被浓缩；这种浓缩机制导致了了鞘细胞内高浓度的CO2，一方面提高Rubisco的羧化能力，另一方面又大大抑制了Rubisco的加氧活性，降低了光呼吸，从而使C4植物保持高的光合效率。PEPC是一类高效特异性表达的酶类，其活性也不受大气中O2浓度的影响，从而使C4与CAM植物在较低CO2浓度的条件下也能进行高效率的光合作用。因此，C4植物具有光补偿点高，CO2补偿点低，光呼吸弱，特别在高温、干旱等逆境条件下具有明显的生长优势。将C4途径关键酶基因导入C3植物以改善C3植物净光合效率一直是植物研究的前沿领域。
大量的研究表明，PEPC基因在植物非生物胁迫中起到重要的作用。例如：盐胁迫和冷胁迫等非生物胁迫可以诱导大麦、拟南芥和高粱中PEPC基因的表达[911]；过表达PEPC基因的水稻在高光和高温调价下具有较高的光合速率[12]；此外，过表达PEPC基因还可以提高植物的耐旱性，而下调PEPC基因则增加了植物对渗透胁迫的敏感性[13]。同时，有研究表明将玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因（ZmPEPC）转入C3植物（水稻[14]、小麦[1517]、拟南芥[18]）中可以提高植物抗旱性。此外，过表达C4关键酶基因植株的酶活、光合效率以及抗旱性均得到不同程度的提高，表明将C4关键酶转入C3植物可能达到改善C3植物品质的预期效果。此前将外源C4基因导入C3植物大豆中的报道主要是关于抗病、抗虫和抗除草剂等性状[19]，目前，还没有在大豆中引入C4途径关键酶基因PEPC改善其耐旱性的研究报道。本实验通过对转基因植株进行阳性鉴定（除草剂草丁膦涂抹），并对转基因植株和对照植株的外部形态差异进行比较和测定相关耐旱性生理生化指标（叶片相对含水量、基因表达量），来阐明过表达ZmPEPC对大豆耐旱性的影响，为大豆等C3植物的耐旱性基因工程育种提供理论基础和材料支撑。

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