本试验通过给饲喂不同铜水平日粮的大鼠灌喂blaCTX-M阳性接合子，探讨高铜和抗生素对blaCTX-M在大肠杆菌间水平传播的影响。试验以32只SPF级大鼠为对象，分为正常铜对照组, 正常铜灌药组，高铜对照组，高铜灌药组。在特定时期给所有大鼠灌胃菌液，给灌药组大鼠灌喂治疗剂量的盐酸头孢噻呋，未灌药组大鼠灌喂等体积食用油。采集大鼠粪样，进行平板计数，对分离株进行抗生素敏感性检测。结果表明灌喂抗生素后，灌药组耐药菌数量极显著高于其相对应对照组，且停止用药后高铜组耐药菌消失的速度慢于正常组。综上所述，高铜促进了耐药基因的水平传播和维持，但在高铜与抗生素共同存在时，抗生素对于耐药菌的维持效果更加明显。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 2
引言 2
1 材料与方法 3
1.1 菌株来源 3
1.2 试剂和仪器 3
1.3 灌喂接合子菌株的制备 3
1.3.1 接合转移试验 3
1.3.2 接合子的鉴定与保存 3
1.4 动物试验设计 4
1.4.1 试验准备与分组 4
1.4.2 动物试验过程 5
1.5 肠道细菌平板计数及肠杆菌的分离保存 5
1.6 抗生素敏感性检测 5
1.7 铜敏感性检测 6
1.8 抗性基因检测 6
1.9 数据处理与分析 7
2 结果与分析 7
2.1 构建的灌喂菌株接合子blaCTXM基因的PCR检测结果 7
2.2 灌喂菌株接合子抗生素和铜敏感性检测结果 9
2.3 Mac肠道杆菌和耐受CTX肠道杆菌计数结果 10
3 讨论 12
4 结论 13致谢 13参考文献 14
饲料高铜对大肠杆菌blaCTXM基因在大鼠肠道内转移的影响
引言
广谱头孢菌素（extendedspectrum cephalosporins, ESCs）被世界卫生组织认为是人类医学中“至关重要的抗 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ￥351916072￥ 
菌药”[]。头孢噻呋是在动物生产上被广泛使用的第三代广谱头孢菌素，对革兰氏阴性菌和阳性菌都有比较强烈的杀灭作用，因此被一些国家用于动物呼吸系统，乳腺炎，腹泻等疾病的治疗[]。头孢类抗生素绝大部分属于人用抗生素，细菌对头孢噻呋耐受后很容易对其他类头孢菌素产生抗性，所以如果头孢菌素在畜禽生产上使用不当，就很有可能威胁人类生命。更令人担忧的是，有研究指出广谱头孢菌素的耐药性不仅可以通过耐药菌的克隆增殖来传播（即耐药基因垂直传递到后代），还可以通过位于可移动遗传元件（整合子、质粒和转座子）上的耐药基因的水平转移（接合，转化或转导）来进行传播[]。头孢噻呋的耐药基因主要由β内酰胺酶介导[]。β内酰胺酶中有一种较为常见的酶，在引起大肠杆菌等革兰氏阴性菌对广谱β内酰胺类抗菌药物耐药中扮演着重要的角色，它就是超广谱β内酰胺酶（extendedspectrum βlactamses, ESBLs）。ESBLs发现至今已有上百种，大多由质粒介导耐药基因进行传播。根据分子结构和来源的不同，可分为TME、SHV、OXA、CTXM和其他型五种[]。据报道，近来，世界范围内多个国家报道了大肠杆菌中超广谱β内酰胺酶（ESBLs）的快速传播，并且受到激烈的讨论[,]。其中，CTMX型ESBLs已成为中国、日本等亚洲国家的主要基因型，同时也有成为欧美等发达国家主要基因型的趋势[]。因此，对CTMX型ESBLs的耐药性的研究日益紧迫。
铜既是有效的抗菌剂，也是生物体维持生长和健康不可缺少的的微量元素，在多种细胞过程中起关键作用[]。饲料中添加高铜被认为具有促进动物生长，提高日增重，改善饲料利用率等作用，因此被较为广泛的应用于畜牧生产中[]。但动物对铜的吸收能力有限，饲料中高铜大部分滞留在肠道食糜中，使得肠道细菌因长期暴露在高铜的环境中而被诱导出铜抗性。同时未吸收的铜会随着动物粪便排出，逐渐沉积在土壤和污水中，诱导环境细菌的铜抗性[]。
随着抗生素在畜禽养殖上的广泛使用，其在畜产品中所导致的细菌耐药性的形势变得日益严峻[]，渐渐开始影响人类生活。因此人们开始对抗生素的使用加以限制，虽然这一举措让耐药菌的数量及耐药程度得到了一定程度的控制，但是仍然存在，并没有完全消失。这可能与其他因素，例如重金属对耐药菌的作用有关。有研究发现，在革兰氏阳性菌中，铜等重金属可能会影响耐药细菌的耐药范围[]，也有研究表明肠球菌的铜抗性基因（tcrB）和四环素、大环内酯类和糖肽耐药基因在遗传物质水平上有联系[]。但在革兰阴性菌中，如大肠杆菌中，铜抗性和抗生素耐药性之间的具体机制尚不明确。因此本试验观察了在饲料源高铜和头孢噻呋压力下，灌喂外源性接合子（质粒携带blaCTXM1基因）后，SPF级大鼠肠道内大肠杆菌数量的变化规律，旨在阐明动物肠道杆菌耐药性形成过程抗生素和无机铜之间的相互关系，并通过比较有无抗生素组和不同铜日粮水平组的细菌耐药水平的差异，为寻求有效控制耐药应答和耐药性转移的营养策略提供依据。
材料与方法
菌株来源
构建灌喂接合子菌株的blaCTXM1阳性供体菌为本实验室保存的大鼠粪源大肠杆菌分离株；受体菌为大肠埃希氏菌EC600（耐利福平），由香港理工大学深圳研究院惠赠质控大肠埃希氏菌株（ATCC 25922）（药敏试验用），购于广东微生物菌种保藏中心。
试剂和仪器
主要试剂：麦康凯琼脂（MacConkey Agar，MAC)，营养琼脂（Nutrient Agar, NA）,营养肉汤（Nutrient Broth，NB），均购于北京奥博星生物技术有限公司。LB琼脂（Laked blood Agar），LB肉汤（Laked blood Broth），MH琼脂（MuellerHinton Agar, MHA），MH肉汤（MuellerHinton Broth, MHB），均购买于青岛海博生物技术有限公司。盐酸头孢噻呋（艾呼克）购于西班牙海博莱生物大药厂。五水硫酸铜（CuSO45H2O）购于上海国药集团。萘啶酮酸、头孢噻呋钠、头孢噻肟钠、盐酸环丙沙星，均购于大连美仑生物技术有限公司。氨苄西林、氟苯尼考均购于南京龙斌生物科技有限公司。盐酸四环素、硫酸庆大霉素均购于生工生物（上海）股份有限公司。
主要仪器：微量移液器（Eppendorf，德国），高压灭菌锅（致微仪器有限公司），超净工作台，恒温震荡培养箱（Crystal，美国），隔水恒温培养箱（BINDER，德国），超微量分光光度计NanoDrop2000(Thermo scentific,美国)，PCR扩增仪（Applied biosystems，美国），电泳仪（北京市六一仪器厂），凝胶成像分析系统（BioRad，美国）。

原文链接：http://www.jxszl.com/yxlw/dwyx/57098.html