本研究基于病毒诱导的基因沉默方法，利用本实验室建立的TYMV基因沉默体系沉默BcMLPK基因，验证该基因的功能。采用芜菁黄化花叶病毒（TYMV）侵染的方法，选取不结球白菜BcMLPK基因，构建pTY-MLPK载体，然后用基因枪方法侵染不结球白菜‘矮脚黄’自交不亲和系，利用实时定量RT-qPCR鉴定基因的沉默效率，并统计基因沉默植株的自交亲和指数。pTY-MLPK侵染‘矮脚黄’的结果表明，其新生的真叶有明显的褶皱花叶等症状，选取发病的叶片及花蕾进行实时定量RT-qPCR鉴定，发现侵染的植株中BcMLPK基因表达量约为对照组的一半。花期对植株进行套袋自交授粉，之后实验组有明显的结荚现象，而对照组则出现柱头萎缩，授粉不良的现象。统计结果表明实验组的自交亲和指数要高于对照组。这些现象说明BcMLPK基因参与不结球白菜自交不亲和的正调控。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法3
1.1 植物材料 3
1.2 方法 3
1.2.1 植物生长和采收3
1.2.2 BcMLPK的cDNA克隆与TYMV病毒载体pTY的构建3
1.2.3 BcM LPK基因的序列及生物学分析3
1.2.4 病毒侵染和微粒轰击3
1.2.5 实时定量RTqPCR反应4
2 结果与分析4
2.1 不结球白菜BcMLPK基因的序列及生物学分析4
2.2 BcMLPK基因在基因沉默中的表达分析5
2.3 BcMLPK基因侵染的植株结自交亲和指数分析6
3 讨论 6
致谢7
参考文献8
不结球白菜BcMLPK基因的自交不亲和性功能验证
引言
不结球白菜( Brassica campestris ssp． chinensis Makino)为十字花科芸苔属植物，原产中国，俗称青菜、小白菜等，是广受我国南方大众喜欢的蔬菜，在我国蔬菜的周年供应中占据重要地位[1]。不结球白菜是典型的异花授粉植物，具有自交不亲和性。自交不亲和性是指植株柱 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ^351916072# 
头能够识别与自身基因型相同的花粉而抑制花粉管的发育，从而导致无法受精的现象。这是植物在长期进化过程中形成的一种防止近交促进异交、提高变异率的机制，也是加速被子植物进化的重要原因之一[2]。十字花科的蔬菜杂种优势明显，但这一特性却会使作物自交衰退显著，不易得到纯系，从而限制了其发挥产量潜力，育种时繁殖种子常用的方法是蕾期自交法，但是对人力和物力耗费较大，因此选育杂交种存在着不少的困难，通过杂种优势选育自交不亲和系已然成为提高十字花科作物产量、改良其品质的重要途径之一[3]。
自交不亲和性(Selfincompatibility, SI)根据遗传控制方式不同可以分为配子体自交不亲和和孢子体自交不亲和[4]。十字花科芸苔属植物为典型的孢子体自交不亲和，起初认为其在遗传上受复等位基因S位点（Slocus）控制[5]，且已经分离出了三个[6]与S基因座紧密连锁的基因：S位点糖蛋白基因（Slocus glycoprotein，SLG）、S位点受体激酶基因（Slocus receptor kinase，SRK）和S位点半胱氨酸富集蛋白基因（Slocus cysteinerich protein，SCR）。
后来，M位点激酶（Mlocus protein kinase）基因MLPK在完全丧失自交不亲和性的芜菁（B. rapa L.）隐性突变体‘ Yellow Sarson C634’（S8/S8mlpk/mlpk）中被鉴定，且参与自交不亲和信号转导的正调控，并对S位点具有上位性[7]。Goring等的M位点突变体转基因实验表明，亲和性突变体被导入MLPK基因后能获得自交不亲和的特性，此现象或许意味着臂重复蛋白 1（ARC1）的不完全抑制或存在一种新的信号途径[8]。而在人工创制的SRKbSCRb拟南芥自交不亲和植株中，采用TDNA插入突变或人为 miRNA干扰的方法分别下调或关闭拟南芥中BcMLPK类似基因AtAPK1a，AtAPK1b[9]的表达，对SRKbSCRb植株自交不亲和性均无影响[10]。后来Elhaddad等证明了APK1b参与了响应光时气孔打开的过程[11]，和拟南芥的自交不亲和反应并没有直接关联。综合以上所述的研究，MLPK在不同的物种中功能有差异。而后续相关研究均无证明不结球白菜BcMLPK基因与其自交不亲和性有关。
病毒诱导的基因沉默(Virusinduced gene silencing,VIGS)属于转录后的基因沉默(posttranscriptional gene silencing,PTGS)，是一种天然的免疫机制[12]。相比于传统的遗传转化方法，VIGS技术作为一种新型的病毒侵染方法，能够避免大量筛选突变体，可以在当代就完成对目标基因的验证，无需获得可以稳定遗传的转化植株后代，是一种操作简单、周期短、结果可靠的研究植物基因功能的方法[13]。芜菁黄化花叶病毒（Turnip yellow mosaic virus，TYMV）是一种高等植物病毒，具有正义RNA链，可以侵染许多十字花科植物[14]，是理想的VIGS载体。
当携带目的基因片段的VIGS载体被转入植物后，植物会对入侵的病毒做出响应，自身的免疫系统会被激活，进而产生双链RNA（Double stranded RNA，dsRNA），然后双链RNA被切割成小分子干扰RNA（Small interfering RNA，siRNA），这一过程主要在RNase Ⅲ家族特异性核酸内切酶Dicer类似物的作用下进行，RNA依赖RNA 聚合酶（RNAdependent RNA polymerase，RDRP）催化它们进一步扩增与AGO1蛋白等结合形成RNA 诱导的沉默复合体（RNAinduced silencing complex，RISC），该复合体能与植物的同源mRNA相互作用，共同切割靶细胞相应的片段，使得同源mRNA降解，这就是VIGS发生的整个过程[15]。
本实验通过基因枪法将携带BcMLPK基因的VIGS载体导入到自交不亲和‘矮脚黄’材料中，通过基因沉默的方法使该基因的表达量降低，从而验证BcMLPK基因是否与不结球白菜自交不亲和性有关。

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