N-乙酰基转移酶作为一种重要的酰基转移酶，广泛的分布在细胞浆和细胞核中，参与蛋白质的乙酰化和去乙酰化。本实验以沙雷氏菌FS14菌株基因组DNA为模版，对N-乙酰基转移酶05435基因进行PCR扩增，克隆到pCold载体，转入感受态细胞C43（DE3）中进行诱导表达， 经SDS-PAGE蛋白质电泳确定N-乙酰基转移酶05435能有效表达，并通过条件优化找出最适合的蛋白质表达条件，通过Ni-NAT亲和层析初步纯化，分子筛进一步纯化了蛋白。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.1.1质粒和菌株2
1.1.2培养基2
1.1.3酶和试剂2
1.1.4主要仪器2
1.2实验方法 2
1.2.1目的基因的PCR扩增2
1.2.2重组质粒的构建3
1.2.2.1回收片段转入感受态3
1.2.2.2碱裂解法提质粒3
1.2.2.3重组质粒的酶切鉴定4
1.2.3表达产物的诱导4
1.2.3.1重组质粒转入感受态细胞4
1.2.3.2重组蛋白的检测表达4
1.2.4表达产物的纯化4
1.2.4.1重组蛋白的条件优化4
1.2.4.2 NiNAT亲和层析4
1.2.4.3 凝胶过滤层析5
2结果与分析5
2.1酰基转移酶05435基因的PCR扩增5
2.2重组质粒的构建6
2.3表达检测7
2.4表达产物的纯化7
3讨论 9
致谢10
参考文献10
沙雷氏菌FS14中酰基转移酶基因（05435）的克隆、表达及蛋白纯化
引言
引言
酰基转移酶(acyltransferase)是一个多功能蛋白质大家族，包括N乙酰基转移酶、组蛋白酰基转移酶等，不同的酰基转移酶在生物体遗传、基因表达、物质代谢、信号传导等 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: *351916072* 
方面起着重要的作用[1]。其最主要的功能是催化蛋白质的酰基化和去酰基化。本课题研究的就是N乙酰基转移酶。
N乙酰基转移酶(Nacetyltransferase ，NAT)是一个二相代谢酶，催化乙酰基团转移到其作用底物芳香胺及杂环胺类物质上[2]，从而活化或灭活芳香胺类致癌物质，在动植物生理调节方面起着重要作用。
目前N乙酰基转移酶的研究主要集中在动物和植物方面。研究表明，NAT2的多态性与膀胱癌、肝癌、胃癌等的发生息息相关[3]；而在植物方面，Castle发现草甘膦N乙酰转移酶基因（gat）能通过N乙酰化的作用使草甘膦转化为无毒的N乙酰草甘膦[4]，这一发现为开发抗草甘膦转基因作物开辟了一条新的途径[5]，通过DNA shuffling的方法使该酶的转乙酰基活性提高了7000倍，并在转入植物后得到了高效表达[6]。关于N乙酰基转移酶在微生物体内的功能的研究寥寥无几。
近年来，随着宏基因组学的不断发展，科研工作者们开始将目光转移至曾经难以开发利用的环境微生物[8]，粘质沙雷氏菌就是其中的代表。沙雷氏菌在自然界中分布广泛，常见于水和土壤中，危害作物健康，而且也是临床上常见的条件致病菌[7]。
本实验对实验室分离的沙雷氏菌FS14中的酰基转移酶（05435）进行体外表达，并进行蛋白表达及条件优化，促进酰基转移酶在生产生活中的运用。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 菌株和质粒
表达载体： pCold由实验室保存；
克隆菌株：大肠杆菌（Esherichia coli）菌株DH5α；
表达菌株：Esherichia coli C43（DE3），由本实验室保存；
粘质沙雷氏菌FS14（Serratia marcescens FS14)为本实验室从白术茎秆中分离得到，由本实验室保存。
1．1．2 培养基
LB液体培养基：酵母提取物5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，氯化钠10 g/L；
LB固体培养基： 酵母提取物5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，氯化钠10 g/L，琼脂粉15 g/L；
1．1．3 酶和试剂
pfu DNA聚合酶、限制性内切酶（Nde I、Xho I）、T4DNA连接酶、DNA标准分子量GeneRulerTM 1 kb DNA Ladder，购自Thermo公司；蛋白Marker（分子量分别为：97、56、42、25、16kDa）；DNA凝胶回收试剂盒购自BioTeke公司；异丙基硫代－β－Ｄ－半乳糖苷（IPTG）、氨苄青霉素（Amp）、酵母提取物购、胰蛋白胨购自上海生工公司；琼脂粉购自青岛海博生物技术有限公司；其他常规试剂购自南京寿德实验器材有限公司，各种化学试剂均为分析纯。
1．1．4 主要仪器
PCR扩增仪（Applied Biosystems，2720 Thermal Cycler）购买于基因有限公司；721型可见分光光度计购自上海舜宇恒平科学仪器有限公司；稳压稳流电泳仪（DYY6B）购自南京科弋创生物科技有限公司；常温高速台式离心机（H165W）购买于长沙湘仪离心机仪器有限公司；低温冷冻高速离心机（SORVALL RC 6+）购自于Thermo Electron Corporation；隔水式恒温培养箱（GSP9050MBE）为上海博讯实业有限公司医疗设备厂生产；台式恒温振荡器（THZC）选购于太仓市华美生化仪器厂；超净工作台（SWCJ18U）购买于苏州安泰空气技术有限公司；凝胶图像分析系统（Tanon GIS2500）购自上海天能科技有限公司；垂直式蛋白电泳槽（DYCP31BN）为北京六一仪器厂生产。

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