番茄斑萎病毒属（Tospovirus）在分类学上属于布尼亚病毒科（Bunyaviridae），是该科中仅有的一种能够侵染植物的病毒属，该属病毒寄主范围广，危害严重，在世界范围内引起巨大的经济损失。番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus, TSWV）是番茄斑萎病毒属的重要代表种。番茄免疫受体蛋白Sw-5b通过识别病毒编码的移动蛋白NSm对包括TSWV在内的多种番茄斑萎病毒属病毒发挥广谱抗性。实验室前期研究Sw-5b与NSm的识别机制时构建了一系列的Sw-5b突变体，其中Sw-5bM5突变体的氨基酸序列变化较大且其识别NSm从而诱导过敏性坏死反应（Hypersensitive response，HR）的能力减弱。为明确Sw-5bM5的突变位点对Sw-5b抗性的影响，本研究利用烟草叶盘法转基因技术获得了稳定表达Sw-5bM5 的转基因烟草，为后续检测Sw-5bM5对TSWV乃至其它番茄斑萎病毒属病毒的抗性奠定了基础。
目录
摘要 3
关键词 3
Abstract 3
Key words 3
引言 3
1 实验材料与方法 6
1．1 实验材料 6
1．1．1 植物材料 6
1．1．2 病毒来源 6
1．1．3 载体和菌种 6
1．1．4 抗病基因 6
1．1．5 生化试剂 6
1．2 实验仪器 6
1．3 常用试剂及培养基的配置 6
1．3．1 常用试剂的配置 6
1．3．2 常用培养基的配置 6
1．4 实验方法 7
1.4.1 烟草叶盘法转基因技术 7
1．4．2 农杆菌浸润 8
1．4．3 过敏性坏死反应（HR）观察和拍照 8
2 结果与分析 8
2．1 Sw5bM5突变体转基因本氏烟的获得 8
2．1．1 烟草前期处理 9
2．1．2 共生培养基（CM）上的烟草叶盘培养 9
2．1．3 出芽培养基上的烟草叶盘培养 10
2．1．4 生 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ^351916072* 
根培养基上的烟草培养 11
2．1．5 生根烟草移至蛭石于温室中培养 12
2．2 对NSm产生HR的植株进行收种 13
3 讨论 13
致谢 15
参考文献 16
Sw5bM5突变体转基因本氏烟的获得
引言
生物为了在自然界的存活和繁衍，都要不断抗争、战胜逆境、适应环境。植物虽然相比于动物在空间移动能力上有先天的不足，但面对逆境时他们也不会就此屈服。它们进化出了自己独特的战斗方式[1]。当各种病原物侵染为害植物时，植物会进行反抗，绝大多数的病原物在植物的反抗过程中会被阻碍，这种现象即为植物表现出的抗性，植物普遍存在这种抗病能力，这种抗病能力在物种上并不表现出特异性，因此被称作非寄主抗性，广谱是其最大最重要的特征表现。植物细胞的表面存在一种模式识别受体(Pattern Recognition Receptors, PRRs），植物通过这种模式识别受体来启动自身的防卫反应，抵抗病原物入侵。这种由植物利用模式识别受体PRRs 来识别侵入植物体内的病原物，导致病原物相关分子模式（Pathogenassociated Molecular Pattern,PAMPs）启动，这种抗性反应即被称为PTI (PAMP triggeredimmunity, PTI)[2]。此外，病原物还会产生一种效应因子，这种病原物的效应因子会触发植物的一种免疫反应（effectortriggered immunity, ETI），ETI它比 PTI 的作用程度更加强烈，效果更加明显，它的工作原理是因为效应因子被某基因的编码产物所识别，产生一系列反应，从而导致病原物无法侵入寄主体内，因此由病原物编码的这种效应蛋白就被称为效应因子或无毒基因（Avirulence gene, Avr gene），相反，能够翻译出这种蛋白的基因即为抗性基因（Resistance gene, R gene）。
由此，“基因对基因”假说应运而生，假说认为如果寄主中每存在一个抗性基因R，与之相应，病原物中也会存在一个无毒基因Avr。这种寄主抗性要求的门槛十分高，出现的条件十分严格。只有当病原物中存在无毒基因Avr 时，寄主也同时存在抗性基因R，且两种基因产生相互作用时才会出现；而在不含R基因的植物寄主内，Avr 则作为毒性基因，其功能会抑制植物发生防卫反应[3]。效应因子要诱发免疫反应，必须存在无毒基因Avr 蛋白以及抗性基因R蛋白两者之间产生的相互作用，由效应因子引起的“基因对基因”的寄主抗病性能否对机体产生作用，使病原物无法入侵，抗性基因Avr蛋白和抗性基因R蛋白两者存在的这种相互作用十分关键。因此病原物的无毒Avr基因寄主植物的R基因的相互作用机制研究十分受关注，并且已在某些方面取得了相当重要的研究进展[4]。
番茄斑萎病毒属（Tospovirus）在分类上属于布尼亚病毒科（Bunyaviridae），是该科中仅有的一种能够侵染植物的病毒属，番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus, TSWV）是番茄斑萎病毒属的重要代表种[5]。不同种类番茄斑萎病毒属病毒，其寄主范围具有很大的差距，表现出种类的多样性[6]。TSWV寄主植物范围非常广泛，对84个科1 000余种植物都具有侵染能力[7]，在世界各地广泛分布，危害严重，造成巨大的经济损失。但也证明了该病毒在经济价值和研究价值上有巨大的发展前景，潜力无穷。TSWV在不同的寄主上引起不同的症状，烟草被TSWV侵染为害, 会出现黄化、坏死斑点、斑块的现象，在经济上造成严重的损失[8]。在南非、巴西和美国夏威夷的某些地区，由于各种因素，番茄斑萎病毒的发病范围和发病程度都极其惊人，给人们带来了极大的困扰，经济受到严重损失，部分居民最后不得不放弃种植和生产。历史上某些年份，TSWV严重危害夏威夷的莴苣等作物，损失率高达50%90%[9]。
TSWV 病毒粒体呈球状, 直径约80110nm[10], 有一层脂质囊膜包裹在粒体外层, 这种脂质是由二种多糖蛋白组成，分别为 Gn 和 Gc 。植物病毒一般不具有膜包被的情况，至今为止，我们只发现了TSWV这一种植物病毒具有脂质膜包被。TSWV是一种负链RNA的病毒，3条单链 RNA 组成其基因组，这3条RNA包括 L RNA（长度约 8.9 kb）、M RNA（长度约 4.9 kb）和 S RNA（长度约2.9 kb）。TSWV基因组的3条RNA 末端都存在保守的一小段互补序列，这段序列可使RNA9、自身首尾相连，连接成一个类似于锅柄状的结构[10]。
番茄斑萎病毒属病毒主要以昆虫蓟马为媒介，通过蓟马的活动进行传播。西花蓟马（Frankliniella occidentalis）是蓟马中的一种典型且重要的传播介体。2003年，中国首次检测到西花蓟马[11]，之后的年份中国检测到的西花蓟马越来越多，产生的危害越来越严重，危害范围也在不断扩大，给生产和经济带来了极大的损失。蓟马的若虫取食病株从而获毒, 所需的获毒时间约10 min甚至更短, 而成虫不能获毒。传毒方式为带毒的若虫可通过蜕皮、蛹化将毒传给成虫[10]。还有其他方式也可传播TSWV，例如汁液机械方式。同时，也曾有报道称番茄种子也可传播病毒[12]。蓟马传播TSWV的方式十分独特，属于循环增殖型传播，与其他介体有着很大区别。这种传播方式最大的特点就是循环增殖，这意味着只要一旦介体开始获得并携带病毒，那么便会终生携带病毒，无法去毒，直至死亡。该病毒甚至能在介体昆虫的体内进行自行复制，从而提高传播效率[13]。由于TSWV寄主广泛，且其传毒的昆虫介体蓟马抗药性十分强大，导致了该病毒造成的病害极难防治。

原文链接：http://www.jxszl.com/nongxue/zwbh/561551.html