转基因技术的日渐盛行和在科学研究中的位置越加不可或缺，衍生出了很多的转基因的方法，如农杆菌介导转化、花粉管通道法、核显微注射法等，在现代科学研究中扮演着不可或缺的角色。玉米属于单子叶植物，相对而言的主要方法是根癌农杆菌介导的方法，转化率高，不易产生嵌合体，但农杆菌介导的难获得单子叶作物载体转化。因此对于玉米的基因，尤其是本文所研究的TS2，选择采用先进的Gateway技术是更好的选择。Gateway技术是克隆和亚克隆DNA序列的一项新式的广适用性系统，方便于对功能基因的分析和蛋白质的表达。只要进入这个多功能的操作系统，DNA片段就可以通过位点特异的重组在载体之间转移。本研究将在玉米性别决定基因TS2与Gateway技术的运用上有重要意义。
目录
摘要 3
关键词 3
abstract. 3
Key words 4
引言 4
1.材料与方法 5
1.1供试材料 5
1.2目的基因克隆与载体构建： 5
1.2.1 目的基因的克隆（TS2的克隆） 5
1.2.2转基因载体的构建方法 6
2 结果与分析 7
2.1目的基因的获得 7
2.2目的基因成功转入中间载体pDONR201 7
2.3 TS2基因转入目的载体 8
2.4 目的载体中TS2基因结果的测序 9
2.5 目的基因的瞬时表达 9
3讨论 10
3.1 转基因表达载体的构建方式 10
3.1.1传统载体的构建方法 10
3.1.2 Gateway技术 10
3.2玉米TS2基因转基因载体的构建 11
致谢 12
参考文献: 12
玉米TS2（Tasselessd2）基因转基因表达载体的构建
种子科学与工程122班学生 蔡佶君
引言
玉米（Zea mays L.）是禾本科玉米属一年生草本植物，玉米在我国的种植历史有470年左右，当前我国栽培面积约为3亿亩，在粮食作物种植中仅次于稻麦，排在第三位，在世界上居第二位。分子生物学研究
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发现，玉米的性别决定基因TS2蛋白是隶属于SDR超家族乙醇脱氢酶的一种，它可能参与植物的性器官生长发育[1]。玉米的性别决定是由一个发展的级联导致单性小花来自最初的两性花分生组织的形成控制[2]。理解TS2基因序列对深入认识单性花和两性花起源的基因特征和生理功能的进化奠定了基础。所以本文将对玉米的TS基因进行转基因表达载体的构建。目前也已经有不少转基因表达载体构建的例子，如谢龙旭，徐培林等构建了含草甘膦抗性突变基因(aroAM12)和人工合成重组Bt 抗虫基因(Bts1m)的植物表达载体pCM12s1m[3]；李燕，孙彦等根据已经克隆得到的MsZIP基因（GenBank序列号：HQ911778，扩增编码区cDNA，构建植物超表达载体PBIMsZIP[4]。以及在大麦中使用转基因的技术等[5]。
转基因技术使得单个基因的功能鉴定以及目标性状的筛选起到了关键的作用。然而，转化体系的低效率，转基因的载体匮乏使得这一技术进展缓慢。大部分可用的的载体启动子来自于双子叶植物，而这样的启动子大多不能用于单子叶作物的转基因研究，而经济作物玉米小麦等均为单子叶作物。目前单子叶转化方法主要有两种基因枪法和农杆菌介导转化法，相对来说，农杆菌转化率高，不易产生嵌合体，可用于农杆菌转化的单子叶作物载体难获得。
转基因技术是把人工分离修饰的基因导入到生物体基因组中，其目的是改造生物本身。因为导入的基因在生物体中表达，引发一些生物体的改变，包括性状，可遗传的修饰，这一技术又名人工转基因技术（Transgene technology）。主要方法有农杆菌介导转化、花粉管通道法、核显微注射法等。在植物中，农杆菌介导转化最常用，但适用于单子叶植物，如玉米的载体难以获得。而Gateway技术可以构建所需载体。
Gateway技术是一种简便的基因操作技术，也被当做克隆操作平台：在把目的基因克隆到入门载体（Entry Vector）后，靠载体上具有的特定重组位点和重组酶而不是依靠于限制性内切酶，目的基因可以被高效、迅速地克隆到其它的目的载体（Destination Vector）上。将噬菌体DNA定点整合到细菌宿主基因组上是Gateway技术的原理。靠噬菌体和细菌的整合因子（INF、Int）的作用，λ噬菌体的attP位点和大肠杆菌(Escherichia coli)基因组的attB位点能够产生定点重组，λ噬菌体DNA整合到大肠杆菌（Escherichia coli）基因组DNA，双方产生了两个新位点attL和attR。这是一个可逆的过程，若在一个噬菌体编码蛋白Xis和IHF、Int的一起介导下，attL，attR这两个新位点可以再次重组变为attB和attP位点，噬菌体就将会从细菌基因组上裂解下来。这一过程的方向是由两个重要因素控制：介导的蛋白和重组位点的存在。
本文利用Gateway技术构建了一系列可用于谷类作物转基因研究的载体，这套载体体系具有不同的启动子，包括玉米启动子Ubi，这一系列载体的构建将大大有助于谷类作物的遗传转化研究。本试验目的基因是Ts2，Ts2性别决定基因是最早在玉米中发现的。玉米也是一种优良的植物性别测定遗传系统，如今从雄穗种子( Tassel seed) 突变体中已然鉴定并分离出的玉米雄性基因有Ts1、Ts2、Ts4、Ts5和Ts6。此中Ts1和Ts2突变体植株在雄穗中产生功能性雌蕊, 受粉后有功能的种子能在雄穗花序上形成。现阶段对于玉米雄穗结实基因Ts9有初阶定位。主要方法是使用具有Mu9转座子的原料和豫82杂交，从M2分离群体中获得1株雄穗结实突变株，表现型为雄穗上的雄花中雄蕊发育遭到抑制，退化就不会发生在雌蕊上，雄花转化为雌花。遗传分析表明，该突变性状受1对显性基因控制，初步命名为Ts9[6]。BC1分离群体是以玉米自交系B73与突变体原料杂交构建的，然后使用SSR 标记将Ts9 定位在第1染色体的1.09 bin 区域，处于SSR标记umc2047 和umc1431 之间，距这2个标记之间遗传间隔分别为4.2cM和2.0cM。
1.材料与方法
1.1供试材料
玉米自交系B73，由作物遗传与种质创新国家重点实验室严远鑫课题组提供。
1.2目的基因克隆与载体构建：
1.2.1 目的基因的克隆（TS2的克隆）
实验室已克隆获得TS2序列并分析完成。

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