水稻是世界上重要的农业作物。世界上近一半人口，都以稻米为食。稻米中贮藏着大量贮藏蛋白，约占籽粒干重的6-10％，而谷蛋白占贮藏蛋白80%左右，任何对谷蛋白含量和组成的改变都会引起稻米品质的变化。因此，对水稻谷蛋白的研究是具有很重要的现实意义的。谷蛋白以57kDa前体的形式合成于内质网，之后沿着DV介导的途径转运到PSV，在PSV中，前体谷蛋白会被切割成成熟的酸性亚基和碱性亚基，最终与球蛋白一起沉积形成PBII。水稻突变体S2271具有胚乳粉质的外观表型，通过蛋白质SDS-PAGE电泳发现其谷蛋白57kDa前体增加，而成熟的谷蛋白亚基相应减少。本课题对该材料进行了初定位与精细定位，以期发掘控制谷蛋白合成运输相关的新基因，为培育水稻新品种提供帮助。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.2 方法 2
1.2.1 表型鉴定2
1.2.2 突变体和野生型蛋白的SDSPAGE 分析2
1.2.3 突变体的SSR标记初定位与精细定位4
2 结果与分析6
2.1野生型与突变体表型鉴定6
2.1.1外观表型鉴定6
2.1.2 SDSPAGE鉴定6
2.2 基因的定位与图位克隆 7
2.2.1 初定位 7
2.2.2 精细定位 7
3 讨论 8
致谢9
参考文献10
水稻谷蛋白突变体S2271的遗传分析与基因定位
引言
水稻（Oryza sativa L.）是禾本科作物的模式物种，是重要的农业作物。水稻种子储存着大量的贮藏蛋白，是稻米中仅次于淀粉的第二大贮藏物质。根据溶解性的不同，贮藏蛋白可分为醇溶蛋白（prolamins，可溶解于醇中），谷蛋白（glutelins，可溶解于稀酸稀碱中），清蛋白（albumins，可溶解于水中）和球蛋白（globulins，可溶解于盐溶液中）[1]。水稻胚乳中中谷蛋白的含量最高，占种子中总蛋白含量的的70%以上，对稻米品质具有 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: #351916072# 
重要影响。水稻胚乳中蛋白贮存在两类蛋白体中，分别为PBI和PBⅡ。其中PBI抗酶解，而PBⅡ易被酶解。PBⅡ中贮藏的谷蛋白能够被人体所消化吸收，而PBI中的醇溶蛋白却不能被人体利用。通过SDSPAGE检测到PBⅡ由分子量为22kDa、26 kDa、37 kDa、38kDa、39kDa的多个成分组成；PBI由分子量为10kDa、13kDa、16kDa、57 kDa多肽组成。再经过溶解度分步分离，确定了22kDa、37kDa、38kDa、39kDa、57kDa大小的多肽是谷蛋白，13kDa为醇溶蛋白，10kDa、16kDa、26 kDa为球蛋白。因此，PBI和PBⅡ分别为醇溶蛋白储存体和谷蛋白储存体[2]。水稻中的贮藏蛋白从在ER中合成到被运送并沉积到特定的贮藏体中，是一个复杂的细胞生物学过程。贮藏蛋白的mRNA正确的定位到内质网（ER）是贮藏蛋白能够合成和正确的转运、沉积的前提。水稻各贮藏蛋白的mRNA并不是被随机地转运到ER上的，而是被特异性地转运到ER的不同区域。其中谷蛋白的mRNA被转运到邻近的潴泡型内质网（cisternal ER）中，最终被转运沉积在贮藏型液泡中形成二型蛋白体[3]。水稻中的谷蛋白首先在内质网中以57kDa前体的形式合成，而后剪切掉信号肽，并接受Bip（lumenal chaperon bin`0or accumulating compartment like，PAC）直接进入蛋白质储藏液泡中（Protein Storage Vacuoles, PSV），或被转运至Golgi体并进一步进行加工修饰，缺省的情况下蛋白将通过反面高尔基体管网结构（TransGolgi networks, TGN）形成的致密囊泡（Dense vesicles, DV）被分泌到细胞膜外，但由于谷蛋白带有液泡分选信号（Vacuolar Sorting Signal, VSS），VSS引导DV进入蛋白质储藏液泡，经液泡加工酶的特异剪切形成成熟的酸性和碱性亚基沉积，形成PBII[4]。上述途径任一步骤存在缺陷，都有可能导致谷蛋白不能进入最终目的地PBII，而以谷蛋白57kD前体的形式存在，这类突变体被称为谷蛋白57H突变体，它们是研究谷蛋白合成、转运途径的优良材料[5]。本文所研究的材料S2271就是谷蛋白57kda前体增加的突变体，其胚乳外观呈现粉质不透明的表型，通过SDSPAGE可以发现突变体胚乳中谷蛋白57kda前体增加，而成熟的酸性亚基与碱性亚基减少。通过初定位与精细定位获得造成该突变的目的基因，以期为进一步揭示谷蛋白的合成运输路径提供理论基础。
1 材料与方法
1．1 材料
突变体S2271是来源于宁粳3号的突变体。突变体亲本与籼稻品种Dular构建F2群体，之后利用F2：3来进一步进行基因的图位克隆工作。所有群体均种植在江苏省南京市土桥实验站，种植条件均为大田环境。
1．2 方法
1．2．1 表型鉴定
在灯箱下观察该突变体的异常表型，突变体胚乳呈现粉质不透明的外观，而野生型为透明。
1．2．2 突变体和野生型蛋白的SDSPAGE 分析
1．2．2．1种子蛋白提取
（1）蛋白提取液
Components
脲（Urea）
4 M
SDS
4%
TrisHcl (pH=6.8)
0.125 M
β巯基乙醇（2ME）
5%
加入少量溴酚蓝作指示剂
（2）实验步骤
取野生型种子宁粳3号和突变体种子各1粒，去颖壳后用研磨成粉末，装入2.0 mL管；同时挑取F2：3群体中表现为粉质胚乳的米粒，一半磨成粉末用于提取总蛋白SDSPAGE筛选，对应带胚的另一半用于提取DNA定位。
每份粉末中加入300 μL 65℃温浴后的蛋白提取液，混匀后放置在50℃烘箱过夜；
点样前先混匀，并在室温下12000 rpm离心2min。

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