：灵芝（Ganoderma lucidum）是著名的大型药用真菌，具有极高的营养价值和药用价值。灵芝三萜类化合物是灵芝的主要药用成分之一，具有抗氧化、抗病毒、降血压和抗肿瘤等活性。本文将从灵芝基因沉默体系的建立，和对NADPH氧化酶基因家族功能研究，探讨灵芝三萜调控机制。并得出初步成果：通过沉默 NoxA，NoxB基因的表达，并对其表型研究，表明这个基因家族在ROS的合成，调控灵芝三萜生物合成的重要作用。Nox沉默菌株表现出ROS积累降低，灵芝三萜生物合成下调。
目录
摘要 2
关键词 2
Abstract 2
Key words 2
引言 2
1材料与方法 3
1.1菌株、质粒、试剂 3
1.2 NADPH氧化酶基因克隆及测序 3
1.3生物信息学分析序列特征 3
1.4 NADPH氧化酶基因沉默载体的构建及转化3
1.5转化子验证4
1.6 Real time PCR检测基因转录水平 4
1.7胞内ROS检测 4
1.8三萜测定方法 4
2结果 3
2.1灵芝NADPH氧化酶功能域及进化树分析 4
2.2灵芝NADPH氧化酶基因沉默转化子筛选 6
2.3灵芝NADPH氧化酶基因沉默突变体ROS生成受阻8
2.4灵芝NADPH氧化酶基因通过ROS调控三萜生物合成8
3讨论10
参考文献11
灵芝Nox家族基因的功能分析及对灵芝三萜合成的调节作用
引言
引言
灵芝（Ganoderma lucidum）是我国的一种传统药用真菌。灵芝在分类地位上被认为是隶属于真菌门（Eumycota），担子菌亚门（Basidiomycotina）、层担子菌纲（Hymenomycetes）。灵芝三萜类化合物具有较好的药理活性，到目前被认为是灵芝的主要的有效成分之一，其含量的多少是衡量灵芝质量的重要指标。由于已经完成的灵芝基因组测序工作，为分子遗传学水平研究灵芝三萜生物合成等灵芝基础生物学研究提供数据支持，有利于推动灵芝成为一种新型模
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式药用真菌，从而增加其科研和商业价值。
ROS指的是活性氧物质，主要包括：超氧阴离子（O2•−）、过氧化氢（H2O2）、羟自由基（OH−）等，这些细胞新陈代谢的副产物对动、植物是有毒性的，但是随着NADPH氧化酶基因功能的发现，低浓度ROS也可以作为信号分子在许多动物、植物生理活动中参与重要的作用，如直接杀伤病原物、强化细胞壁、诱导植保素合成、诱导超敏反应（HR）、参与细胞程序性死亡、诱导防卫基因的表达等过程[1]。植物中ROS作为逆境胁迫的次级胁迫，它的释放是植物细胞应答病原菌入侵的早期主要反应之一。该过程ROS的主要来源是NADPH氧化酶。虽然多种ROS参与信号调控的功能在动、植物中广泛被报道，但是真菌中对ROS的研究还处于初级阶段，在担子菌中，特别是灵芝，ROS能否发挥类似动、植物中的作用还有待研究。
NADPH氧化酶（Nox）是一类与活性氧（ROS）合成有关的酶，据报道其在植物与动物中有多种重要的生物学作用。而在丝状真菌，特别是大型担子菌中Nox的具体功能还不完全清楚。在本课题研究中，根据灵芝基因组测序序列，鉴定出NADPH氧化酶基因的两种Nox亚型（NoxA和NoxB）。采用正反双启动子RNAi的方法研究Nox基因家族功能。通过沉默NoxA，NoxB基因，并对其表型进行观察研究，表明这个基因家族在ROS的合成，调控灵芝三萜的生物合成、子实体发育以及抗氧化胁迫等方面有重要作用。Nox沉默菌株的表型为ROS积累降低，灵芝三萜生物合成降低，子实体发育受阻以及对H2O2耐受性降低等。
1 材料与方法
1.1 菌株、质粒、试剂
灵芝（Ganoderma lucidum）菌株G20由上海农科院提供。大肠杆菌DH5α由实验室储存。溶壁酶购自广东省微生物研究所，pMD18T vector、pAN7dual vector、Taq DNA polymerase、限制酶、T4 DNA ligase购自大连Takara公司。所用到的抗生素均购自上海生工生物工程公司，ROS检测试剂NBT（sigma）、荧光染料DCHFDA（sigma）、NADPH氧化酶抑制剂DPI（sigma），其它试剂均为分析纯。
1.2 NADPH氧化酶基因克隆及测序
1.2.1 NADPH氧化酶基因克隆
灵芝基因组测序已经完成（Chen et al. 2012），通过选取Coprinopsis cinerea Nox1 和Nox2编码的氨基酸序列与灵芝基因组序列进行tBLASTn序列比对。根据比对得到的序列全长设计引物。
引物名称
序列 (5′ to 3′)
描述
NoxAF
ATGGGCGAAAATTGGTTCCAG
扩增NoxA cDNA全长
NoxAR
CTAGAAGTGTTCCTTGGCGA
NoxBF
ATGCCGTTCAGCAGGAGGCG
扩增NoxB cDNA全长
NoxBR
CTAGAAGTTCTCCTTTCCGA
1.2.2 NADPH氧化酶基因测序分析
将PCR产物分别连接至pMD18T载体，送华大基因进行测序。
1.3 生物信息学分析序列特征
将克隆得到的序列进行生物信息学分析包括聚类分析：采用MegAlign (DNAStar Inc.) 和 ClustalW (default parameters)进行NoxA和NoxB的聚类分析；以及NADPH氧化酶功能域预测分析（protein BLAST）。
1.4 NADPH氧化酶基因沉默载体的构建及转化
1.4.1 NADPH氧化酶基因沉默载体的构建
构建的载体分别为NoxA沉默载体（pAN7NoxAdual）、NoxB沉默载体（pAN7NoxBdual）以及NoxAB共沉默载体（（pAN7NoxABdual）。
1.4.1.1 noxA、noxB沉默片段的PCR扩增
以灵芝基因组DNA为模板，扩增noxA、noxB基因的特异片段。
1.4.1.2 noxA、noxB沉默目的片段的双酶切、目的片段的回收与克隆
HindIII和BamH I的双酶切体系：
ddH2O 22.5 μL
10×Buffer 1.5 μL
质粒DNA（或目的片段） 5 μL
HindIII 0.5 μL
BamH I 0.5μL

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