为研究中华绒螯蟹羧酸酯酶基因的表达，及其对含有羧酸酯键农药的解毒代谢机制，在已获得羧酸酯酶基因全长序列的基础上，使用软件 Primer5.0设计荧光定量引物，选取β- actin作为内参基因引物，以各组织作为模板进行实时荧光定量 PCR，得到中华绒螯蟹不同组织羧酸酯酶的表达量情况。 挑选合适的河蟹，以肝胰腺为模板进行实时荧光定量PCR，得到河蟹在三种农药诱导下，羧酸酯酶表达量的变化情况。实验结果表明，中华绒螯蟹羧酸酯酶基因在肝胰腺的表达量最多，肠和副性腺的表达量次之，但差距不大。心脏、鳃表达量几乎为零，肌肉和精巢表达量与肝胰腺和肠相比微乎其微。在不同农药的诱导下，肝胰腺羧酸酯酶的表达量随着时间变化峰值也有相应的不同。A农药（beta cypermethrin）诱导下，在12小时后达到峰值；B农药（avermectin）诱导下，在24小时后达到峰值； C农药（trichlorfon）诱导下，在6小时后达到峰值。 可以从基因表达量的变化中看出，羧酸酯酶基因可能参与了分解农药的解毒代谢。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1 羧酸酯酶的简介2
1.1 羧酸酯酶多基因家族的分类和命名2
1.2 羧酸酯酶的组织分布2
1.3 羧酸酯酶水解羧酸酯键的机制3
1.4 羧酸酯酶对有机磷类农药的水解3
1.5 羧酸酯酶对拟除虫菊酯类农药的水解3
1.6 羧酸酯酶对氨基甲酸酯类农药的水解3
2 材料与方法3
2.1 材料3
2.2 方法3
2.2.1 CXE4不同组织的表达3
2.2.2 CXE4对农药的解毒功能4
3 结果4
3.1 CXE4不同组织的表达量情况4
3.2 CXE4对农药的不同反应4
4 讨论与结论6
参考文献7
图1 9中华绒螯蟹羧酸酯酶基因的表达及其对农药耐受性的研究
引言
引言 中华绒螯蟹又名河蟹，大闸蟹，隶属于节肢动物门，甲壳纲，绒螯蟹属。河蟹适应性强， *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ￥351916072￥ 
分布广泛，主要分布于我国沿海诸省各大水系，由此形成长江水系、辽河水系、瓯江水系和闽江水系4个种群。河蟹的肉质鲜美、营养丰富，蟹黄蟹膏常是家常菜和宴席上的珍馐佳肴，故其经济价值和营养价值很高，历来被人们视为水产珍宝，是人们最喜爱的水产品之一，是世界各国水产养殖的重要对象。目前，河蟹养殖已经成为我国水产业中的重要财富和重要支柱产业。
虽然河蟹的养殖规模不断扩大，但其养殖环境也越来越恶劣，病害发生愈加频繁。原因之一就是大量杀虫、杀藻、杀草药等通过地表径流、雨水冲刷、生活废水等途径进入养殖水体，造成养殖水源，或养殖水环境的污染。而且这些农药的残留也有可能成为河蟹养殖过程中的安全隐患，影响河蟹的生长和品质。而CXE4作为一种重要的解毒酶系，能够有效的水解和结合内源性和外源性含有酯键的有毒物质，减缓其到达靶细胞的时间。本实验结合已有的对CXE4生化特性以及增效剂处理的研究结果，综合分析河蟹羧酸酯酶基因对农药作用的应激反应，初步研究羧酸酯酶对农药的解毒代谢机制，为合成相应的抗体奠定基础。
由于目前使用的绝大多数农药都含有可被羧酸酯酶水解的化学基团，因此羧酸酯酶的这一性质为从环境中去除残留农药提供了新的思路和新的途径。然而甲壳类作为重要的水产经济种类，目前仅有的关于 CXE4的研究则是对甲壳类蜕皮生长的影响，对养殖中甲壳类酸酸脂酶对农药抗性的研究甚少。
1 羧酸酯酶的简介
羧酸酯酶（carboxylesterases，CXE4）是一种多功能家族酶系，主要包括α和β两类水解酶家族。CXE4的结构是由Glu、Ser和His组成的，并以Ser残基为中心的三联体，这与Ser蛋白酶的结构相似，同属于丝氨酸水解酶家族中的一员。它能有效地催化水解含羟基酯键、酰胺键和硫酯键的内源性和外源性化合物[1]，同时也可与有机磷化合物结合且活性受到抑制；但不能催化水解乙酞胆碱及类似底物。CXE4的催化中心是由其氨基酸序列中位置于203位的丝氨酸、335位的谷氨酸和448位的组氨酸残基一起组成的[28]，空间构型的二硫键维持其活性中心，它由CXE4氨基酸序列中的45个半胱氨酸形成；此外酶的活性与近N端的糖基化位点密切相关，CXE4的酶稳定性以及色氨酸活性中心的空间结构都与改位点都关[29]。
1.1 羧酸酯酶多基因家族的分类和命名
酯酶的分类依据不一。Aldridge[16]根据酯酶与磷酸酯类化合物的相互作用将其分为A脂酶、B脂酶和C脂酶。A酯酶能够耐受有机磷类化合物，水解底物并不会被其抑制。B酯酶对有机磷很敏感，且能够被其抑制；C酯酶不被有机磷类化合物抑制，又不能水解有机磷类化合物。目前研究的CXE4多属于B酯酶。按照对α乙酸萘酯、β乙酸萘酯水解的先后顺序和在凝胶上的电泳迁移率，以及酯酶和这两种底物反应后被常用的几种重氮染料染色后呈现的颜色,从而确定属于相应一类的酶库[17]。库蚊CXE4是如下被命名的：跑淀粉凝胶电泳，当两个CXE4等量存在时，水解呈蓝色时为 CXEA，水解呈红色时为 CXEB(βNA)[18]。后随着电泳技术及分子生物学技术的发展，通过迁移速率进行分类已经不切实际，因此在1993年提出新的命名体系，即用 Estα代表酯酶A、Estβ代表酯酶B。英文字母排序靠前代表发现的早。用数字表示迁移速率的不同。对于氨基酸序列不同，而酶切位点和电泳迁移相同的则用上标数字标注[19,20]。Satoh等[21]根据蛋白质序列的同源性以及功能域对CXE4进行重新命名。譬如同工酶 CES1到 CES4 四大家族。根据氨基酸序列和功能结构域的差异，又将昆虫CXE4基因分为8大类：α酯酶、β酯酶、乙酰胆碱酯酶、保幼激素酯、gliotactin 、神经连接蛋白、神经趋化蛋白和酰胺类[22]。
羧酸酯酶的组织分布
CXE4在生物界分布广泛，在一些微生物、昆虫、哺乳动物各组织中均有CXE4的发现，其中在肝脏中的酶活性最高[23]。在组织中的表达检测发现，哺乳动物的肝脏、肠道、肺都有CXE4 基因的表达，而且发生在这些组织器官的内质网中[24]。通过检测，哺乳动物的血液中发现有大量的CXE4，但是目前在人的血细胞中并没有发现CXE4基因的表达。在昆虫中，CXE4基因的表达有时空差异性。幼虫时期，CXE4 表达在中肠、脂肪体、马氏管、体壁等组织中。成年昆虫阶段，CXE4 基因主要存在于体壁、腿、触角、头部下颚等组织中。在昆虫发育的不同阶段，CXE4表达量也存在不同[25]。对大麦、玉米、拟南芥等模式植物的研究，表明同功能的CXE4基因大部分表达在叶子表皮、果实种子、根表皮等[26]。一些菌类生物，也能产生大量的COEs[27]。一些真菌也能表达COEs，如果味青霉等。

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