为探索菘蓝生殖生长过程中的开花机理，利用PCR技术对菘蓝IiFLC基因进行克隆和表达分析。在获得的IiFLC基因的cDNA序列全长中含有一条长为585 bp的开放阅读框，可翻译为编码194个氨基酸残基的多肽链，具有典型的MADS-box结构域。通过与十字花科其他植物中的FLC蛋白质序列的比对分析发现，菘蓝与它们具有高度的同源性。实时荧光定量PCR对菘蓝FLC基因的表达量进行分析，表明其在菘蓝不同时期不同器官的表达量有显著差异，其中根的表达量最高，茎的表达量最低，并在抽薹现蕾期至果期呈现明显的先减后增的变化。为研究IiLFC基因的生理功能，构建IiFLC基因的超表达载体pCAMBIA1300-IiFLC并获得转基因植株。表型观察发现，过量表达IiFLC基因抑制了长日照条件下拟南芥的开花，并且抑制了拟南芥AtFT和AtAP1基因的表达。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 试验材料的处理2
1.1.1 试验材料 2
1.1.2 试验材料的培养与取样2
1.2 试验方法 2
1.2.1 菘蓝cDNA的提取2
1.2.2 IiFLC基因引物的设计3
1.2.3 IiFLC基因的克隆3
1.2.4 IiFLC基因的CDS序列分析4
1.2.5 荧光实时定量PCR分析4
1.2.6 IiFLC基因的功能初步分析5
1.2.7 转基因植株的PCR鉴定5
2 结果与分析6
2.1 菘蓝IiFLC基因的克隆与重组质粒的构建6
2.2 IiFLC基因的cDNA序列分析7
2.2.1 IiFLC序列的理化性质7
2.2.2 IiFLC序列的一级结构分析7
2.2.3 IiFLC序列的空间结构分析9
2.3 实时荧光定量PCR分析10
2.4 IiFLC基因的功能初步分析10
2.4.1 抗性转基因植株的获得和PCR鉴 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: *351916072* 
定10
2.4.2 过表达IiFLC基因抑制拟南芥开花11
2.4.3 拟南芥开花相关基因的表达检测12
3 讨论13
致谢14
参考文献14
菘蓝开花抑制基因IiFLC的克隆和表达分析
引言
引言：菘蓝（Isatis indigotica Fort.）属十字花科（Cruciferae）越年生药用植物，药用部位为根与叶。根入药称板蓝根，叶入药称大青叶，且二者入药均性寒味苦，具有清热解毒、凉血消斑的功效[1]。在菘蓝栽培生产中，常采用种子繁殖，其开花须经过冬季低温春化后方可抽薹开花结籽[2]。而目前菘蓝的研究中多集中于其营养生理与药材质量的关系[35]，对其生殖生长过程的研究则较少，而优质种子的获得能有效地提高栽培菘蓝营养生长后期收获其根与叶入药的质量。因此研究菘蓝生殖生长过程中调控其开花的分子机制具有较强的理论与实践价值。
植物抽薹开花的过程是基因与环境因子的共同协调作用的结果[6]，是植物发育过程中从营养生长阶段到生殖生长阶段的重要转变，其中必须通过低温春化作用，而开花抑制基因FLC（FLOWERING LOCUS C）起到了十分关键的作用。研究发现拟南芥中主要有六个不同的开花调控途径，包括温度途径、光周期途径、自主途径、春化途径、年龄途径以及赤霉素途径[7]，而FT基因是花发育途径的汇集点[8]。ASP1（Arabidopsis SUMO protease 1）在长日照条件下诱导了一种强烈的晚开花的突变型，但在短日照下，这种突变表现型较少或几乎没有。通过基因互作的研究分析，ASP1能促进开花的正向调控因子的转录，如FT、SOC1和FD基因，并可能在两个相互依赖的光周期途径和自主途径中发挥作用[9]。
FLC基因是开花抑制基因，在调控拟南芥开花的网络途径中处于十分关键的地位，其表达主要取决于外界环境因子和生长发育阶段的信号[10]。研究发现，FLC基因的过量表达载体在转基因植物中表达，会在一定程度上抑制或者延迟植物的开花[11]，油菜中的BnFLC基因在植物拟南芥中构建过表达会出现开花延迟的现象，拟南芥中的AtFLC基因在油菜中过表达能够使开花延迟2至6周，AtFLC基因在烟草中过表达可延迟开花约一周时间；甘蓝的BoFLC基因在植物芥菜中过表达也可延迟开花约一周的时间。遗传分析表明低温春化能够通过对FLC蛋白的乙酰化与甲基化修饰，进而改变其染色质的结构，使得FLC的表达被抑制，促进其抽薹开花[12]，即春化作用对FLC基因的抑制作用。春化作用可分为以下3个过程：响应低温起始抑制FLC的表达、低温诱导FLC沉默及温度回暖后表观遗传调控FLC沉默[13]。而低温春化处理可以使拟南芥进入提前开花的状态，从而诱导FLC位点的反义转录本的转录，产生大量的COOLAIR RNA以及FLC基因发生转录沉默，在表观遗传学中被认为可以促进植物早花的发生[14]。菘蓝和拟南芥同属于十字花科植物，其开花也可能通过自主途径和春化途径对FLC基因等与开花的相关基因的表达调控来实现，FLC基因的表达水平随着对其低温处理时间的不同而不同，呈负相关关系，从而在冬季低温过程下通过FLC基因表达量的减少而达到开花的目的[1516]。
为进一步研究菘蓝FLC基因调控开花的机理，本研究克隆了菘蓝生殖生长阶段调控其开花的FLC基因，分析其不同器官、不同生长发育时期内的FLC基因的表达情况，并对通过菘蓝过表达载体的构建对FLC基因进行了初步的功能验证，初步探索菘蓝的抽薹过程和开花之间的协调关系，有助于明确菘蓝FLC基因分子调控开花的机理，为阐明FLC基因在菘蓝发育过程中的作用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料的处理
1.1.1 试验材料 实验在大学园艺学院中药实验室和江苏省农科院粮食作物研究所完成，实验材料为山西菘蓝自交一代的种子材料，用于设计引物的基因序列TRINITY_DN82960_c0_g1来源于本实验室菘蓝转录组数据库。哥伦比亚生态型拟南芥（A. thaliana L.）（Col0）种子为本实验室保存。

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