3引言 31材料与方法 41.1实验材料 41.1.1植物材料及实验试剂 41.1.2 cDNA模板的准备 41.1.3表达载体与表达菌株 51.1.4 原核表达及可溶性蛋白纯化所需试剂 51.1.5原核表达主要仪器和服务 51.2 实验方法 61.2.1总RNA的提取和鉴定 61.2.2 引物设计 61.2.3 cDNA第一链合成 61.2.4 快速cDNA末端扩增（RACE） 71.2.5 RACE产物胶回收 81.2.6 RACE产物的In-Fusion克隆 81.2.7 测序结果拼接 81.2.8生物信息学分析 81.2.9 目的基因的获取（含酶切位点） 91.2.10 原核表达载体构建 91.2.11 目的蛋白的诱导 101.2.12 SDS-PAGE检测目的蛋白 101.2.13 CmFLS重组融合蛋白的纯化 102 结果与分析 112.1 杭菊CmFLS的克隆和序列分析 112.2系统进化树分析 142.4 重组融合蛋白的SDS-PAGE电泳结果 152.5 CmFLS重组融合蛋白纯化结果 153.讨论 163.1 CmFls基因cDNA全长克隆和生物信息学分析 163.2 原核表达载体的选择 173.3 重组融合蛋白的表达及纯化 17致谢 17参考文献 18杭菊CmFLS基因克隆和原核表达本研究从杭菊转录组数据库中筛选并通过RACE技术克隆出一条黄酮醇合成酶基因（暂命名CmFLS），简单序列分析表明CmFLS基因全长1 235 bp，包含一个1 008 bp的开放阅读框(ORF)，编码335个氨基酸。预测得到的CmFLS编码的蛋白分子量为37.96 kDa，等电点（pI）为5.41。利用原核表达技术成功诱导出大小43 kDa左右的重组融合蛋白，同时使用Ni-NTA树脂纯分离纯化出重组融合蛋白，并确定使用含250 mM咪唑的Ni-Native Buffer洗脱效果最好。以上研究结果为进一步研究CmFLS的功能、阐明FLS酶的功能机制奠定了基础，同时为从分子水平调控杭菊黄酮醇成分代谢及体外催化合成黄酮醇提供新思路。
目录
引言
引言
杭菊（Chrysanthemum morifoliumcv. Hangju）是《中国药典》（2015年版）收录的药用菊花五大品系之一，具散风清热，平肝明目，清热解毒等 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: *351916072* 
功效[1]。其中黄酮类化合物广泛存在，并且许多药用植物，银杏、红花、陈皮、黄芩、菊花等常用中药中都含有黄酮类成分，并起到药理作用[2]。黄酮醇是类黄酮化合物中的一类，主要是植物根、茎、叶、花、果实和种子中含有，对植物生长发育和抵抗逆境等发挥着重要作用，包括调控生长素转运、促进侧根形成、影响花粉发育、抗紫外线、调节叶片气孔开度等[3]。
黄酮醇合成酶（flavonol synthase，FLS，EC 1.14.11.23）在黄酮醇化合物的生物合成中重要调控酶。在黄酮类生物合成途径中，它对二氢黄酮醇进行反应，催化黄酮结构中的C3位发生羟基化，从而形成各种黄酮醇类化合物[37]。它与黄酮醇、花青素等成分积累有关，同时对植物的部分生长状况，例如花的颜色、种子数量等方面，并且在植物生理活动中起着重要的作用[8]。黄酮醇合成酶的种类以及其编码的基因可通过原核表达的方式进行研究，目前国内外已从多种植物中克隆获得了FLS基因。首条FLS的cDNA序列从矮牵牛（Petunia hybrida Vilm）中克隆得到，反义表达该基因显著减少花瓣中黄酮醇含量，花着色显著增强[9]。目前，已经克隆了很多植物中黄酮合成途径中的结构基因和调节基因，如玉米，金鱼草，烟草，矮牵牛和拟南芥、茶树、小麦、紫山药、金银花、白花蛇舌草、红花等[1014]。
本实验研究从杭菊转录组数据库中使用cDNA末端快速扩增技术（RACE法）获得一条全长黄酮醇合成酶基因（暂命名CmFLS，GenBank accession number: MF124607）。本研究使用原核表达技术，以大肠杆菌作为宿主表达出重组的黄酮醇合成酶蛋白并纯化，从而进一步研究CmFLS的功能，为从子水平调控杭菊黄酮醇成分代谢打下基础。
1材料与方法
1.1实验仪器试剂及材料
1.1.1实验材料
实验植物材料采自于大学药用菊花种质圃，经大学中药材研究所郭巧生教授鉴定为杭菊（Chrysanthemum morifolium Ramat.）品系中的早小洋菊。
表达载体pET29a（用于构建CmFLS重组质粒）由大学中药材研究所自行保存；克隆工程菌感受态细胞DH5α、表达工程菌感受态细胞E.coli BL21(DE3)购自宝日医生物工程（大连）有限公司。
1.1.2 实验试剂
植物RNA提取试剂盒（TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit）、克隆用反转录试剂盒（PrimeScript™ II 1st Strand cDNA Synthesis Kit）、胶回收试剂盒（TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0）、高保真酶（PrimeSTAR® GXL DNA Polymerase）、Premix TaqTM、限制性内切酶（EcoRⅠ和SalⅠ）、T4 DNA连接酶、植物RNA提取试剂盒（TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit）、 RACE试剂盒（Clontech SMARTer® RACE 5/3 Kit）、质粒提取试剂盒（TaKaRa MiniBEST PlasmidPurification Kit Ver.4.0）均购自宝日医生物工程（大连）有限公司；克隆使用TRANS pESAYBlunt Cloning Kit 购自南京百斯凯科技有限公司。LB培养基、Amp、Kan、Xgal、IPTG等。卡那霉素、IPTG、咪唑、过氧化氢酶购自索莱宝生物科技有限公司；SDSPAGE变性丙烯酰胺凝胶快速制备试剂盒、NiNTA纯化树脂预装柱、2酮戊二酸购自生工生物工程（上海）股份有限公司。其他试剂分别是常规分析纯产品。
1.1.3 实验仪器及服务
主要仪器：PTC200 PCR仪（美国Alpha公司）；Nano300超微量分光光度计（杭州奥盛仪器有限公司）；XZ16T高速离心机（长沙湘智离心机有限公司）；GenoSens 1850凝胶成像仪（上海勤翔科学仪器有限公司）。PTC200 PCR仪（美国Alpha公司）； FC1000N超声破碎仪（杭州赛普科学仪器有限公司）；BQZD16全温振荡器（常州普天）；超净工作台（苏洁净化）；电泳槽（上海天能）；电泳仪（北京六一）；TS1脱色摇床（海门麒麟）。
技术服务：DNA测序由南京金斯瑞生物科技有限公司完成；寡核苷酸引物由上海英骏生物技术有限公司合成。
1.1.4 cDNA模板的准备
使用PrimeScript™ II 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒进行cDNA第一链的合成，具体操作步骤如下：
（1）按顺序加入样品和试剂：
总RNA
5 μg 以下
dNTP Mixture (10 mM each )
1 μL
Random 6 mers
1 μL
RNase free H2O

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