为验证日本医蛭唾液腺摄食血餐策略相关基因表达模式，从RNA-seq数据库中筛选日本医蛭不同摄食时期（Unfed Group，Feeding Group和Fed Group）表达差异基因，从TDEGs（Top 100 differential expression Genes）中筛选出摄食血餐策略相关基因，根据基因功能将它们分为免疫响应相关基因、抗凝血系统相关基因、血管管理机制相关基因和能量供应机制相关基因四大类，运用qPCR技术验证其表达模式。结果表明日本医蛭唾液腺摄食血餐策略相关基因均在FIG中特异表达。
目录
摘要 3
关键词. 3
1 材料与方法 5
1．1 试验材料、试剂及仪器 5
1．1．1 试验材料 5
1．1．2 主要化学试剂 5
1．1．3 主要仪器设备 5
1．2 筛选试验候选基因 5
1．3 总RNA提取 5
1．4 cDNA的合成 6
1．4．1 去除基因组 DNA 反应 6
1．4．3 qPCR反应 7
1．4．4 qPCR数据分析 7
2 结果与分析 8
2．1 候选基因表 8
2．2 总RNA提取结果 8
2．3 日本医蛭摄食策略免疫相关基因时空表达情况分析 9
2．4 日本医蛭摄食策略能量供应相关基因时空表达情况分析 10
2．5 日本医蛭摄食策略血管管理相关基因时空表达情况分析 11
2．6 日本医蛭摄食策略抗凝血相关基因时空表达情况分析 12
3 讨论 14
3．1 免疫相关基因 14
3．1．1 TEP家族基因 14
3．1．2 AMP 15
3．2 能量供应相关基因 16
3．3 血管管理相关基因 16
3．4 抗凝血相关基因 17
致谢 17
参考文献 17
日本医蛭唾液腺摄食血餐策略相关基因表达模式验证
引言
日本医蛭 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ^351916072^ 
属于无吻蛭目医蛭科动物[1]，是一种重要的中药材基源动物。从古至今水蛭都被作为一种治疗心脑血管疾病的药物，现代研究发现水蛭体内有水蛭素、血小板聚集蛋白抑制剂及抗血栓形成蛋白等药理成分。水蛭被作为药物使用的记载始见于汉代的《神农本草经》。中国药典（2015年版）收录了三种水蛭动物作为水蛭药材的动物基源，但仅有日本医蛭属于吸血类水蛭。对于水蛭药材质量（抗凝血活性）来说，吸血类水蛭药材质量优于食肉类水蛭[2]。
众所周知，水蛭体内药理活性成分主要由唾液腺分泌。目前，对水蛭唾液腺转录组及蛋白组的研究已较深入。综合前人研究结果，可将水蛭药理成分分为四大类：第一类是抗凝血活性类，包括水蛭素、Antistasin、Therostasin、Guamerin、Haemadin及Bufrudin等，他们主要与凝血酶或凝血因子Ⅹa等凝血因子相互作用，抑制血液凝固。第二类是血小板聚集抑制剂，如Saratin,、Disintegrin、Calin及LAPP。第三类是纤维蛋白降解剂，如Destabillase Ⅰ、Destabillase Ⅱ及Ctype Lectin。第四类是抗菌肽，能抑制微生物的生长，如Destabillase Ⅰ及Destabillase Ⅱ。近年来，多种吸血类水蛭唾液腺已完成了转录组分析，如Haementeria vizottoi[3]， Haemadipsa interrupta[4]，Pontobdella macrothela[5]，Macrobdella decora[6]，Placobdella ali，Placobdella parasitica及Placobdella kwetlumye[7]，其结果证实了各种吸血类水蛭唾液腺中含有多重药理成分。
超过14 000种昆虫具有吸血食性[8]，吸血类动物在摄食时需要对抗宿主的防御系统，这是吸血类动物顺利完成血餐的必要程序。宿主一般有三大防御系统（凝血系统，炎症系统及免疫系统）抵抗吸血类动物吸食他们的血液[9]。研究蜱、蚊子、虻及苍蝇等节肢类动物在摄食血餐时唾液腺或中肠相关药理基因表达模式发现，食血类动物摄食时会分泌抗凝血酶、血小板聚集抑制剂和血管舒张剂等物质对抗宿主的凝血系统。不同的吸血类动物有不同的摄食血餐策略：一些吸血类动物吸食一次血餐会在宿主身上停留数日，它们的唾液腺会分泌一些抗炎蛋白如anticomplement和protease inhibitors等抵抗宿主的炎症系统；另外，食血类节肢动物唾液中包含了一些物质能使宿主被吸血时无疼痛感[10]；此外，在食血类动物吸血过程中也在它们体内发现了抗菌肽和消化蛋白。例如，Ixodes scapularis食血时会在宿主身上停留数天，一次的血液进食量可达自身体重的数倍，在它唾液腺中发现了蛋白酶、蛋白酶抑制剂、免疫蛋白、抗菌肽、脂质运载蛋白等多重药理成份[10]。然而，Haematobia irritans一天内会在牛身上吸血多次，每次只进食少量血液，在它的唾液中只找到一种抗凝物质，而促进血管舒张、血小板聚集抑制剂等物质均未被发现[11]。
日本医蛭摄食血餐的机会较少，因此每次摄食血餐的重量可达自身体重的2.510倍，并储藏于身体两侧的嗉囊内。日本医蛭需要在嗉囊中长期储藏血餐，因为其消化、吸收血餐的过程十分漫长。吸血类动物如蚊子、臭虫等拥有刺吸式口器的节肢动物会将口器插入宿主表皮，但水蛭的口器不会刺入宿主皮肤，仅割破宿主血管周围的皮肤。由于水蛭与这些食血类节肢动物生理及形态学方面的不同，水蛭是否会有一种与它们不同的摄食血餐策略？因此，本研究筛选了RNAseq数据库中FIG特异表达基因（免疫响应、抗凝血系统、血管管理机制和能量供应机制四大类），运用qPCR技术验证不同摄食阶段日本医蛭唾液腺相关摄食血餐策略基因的表达模式。
1 材料与方法

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