目录
摘要Ⅱ
关键词Ⅱ
AbstractⅢ
引言
引言1
1材料与方法3
1.1菌株、质粒、引物和蛋白序列3
1.2主要试剂和溶液4
1.3分子克隆工具酶、试剂盒和生化试剂5
1.4仪器和设备5
1.5原核表达6
1.5.1 LbCas12a蛋白表达载体的构建6
1.5.2 LbCas12a蛋白小剂量诱导鉴定10
1.5.3 LbCas12a蛋白大量诱导表达11
1.6 LbCas12a蛋白纯化11
2结果与分析 12
2.1完成LbCas12a蛋白表达载体的构建 12
2.2 LbCas12a蛋白小剂量诱导鉴定 14
2.3LbCas12a蛋白大量诱导表达及纯化 14
3讨论 15
参考文献17
致谢18
CRISPR/Cas12a基因编辑体系的建立及应用
摘 要
CRISPR/Cas基因编辑技术近年来凭借其简单高效等诸多优势成为研究热点，其Cas12a体系去年首次报道，依赖Cas蛋白精准识别靶标，在下游核酸检测方面显示出良好的应用前景。课题以LbCas12a基因组参考序列为模板合成目的基因，利用Xho I和EcoR I双酶切空载质粒，同源重组整合LbCas12a至pET28TEV，双酶切鉴定后转化至BL21大肠杆菌工程菌，优化反应条件后获得Cas12a蛋白稳定表达体系，并对其进行了纯化和鉴定。研究通过构建LbCas12a蛋白体系，以期应用于下游核酸标记和修饰，为病原微生物的核酸检测提供新的思路。
Establishment and Application of CRISPR/Cas12a Gene Editing System
ABSTRACT
CRISPR / Cas gene editing technology has become a research hotspot in recent years due to its simplicity and e *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ^351916072* 
fficiency. CRISPR / Cas12a system has been reported recently relays on significantly optimizing the recognition system of nucleic acid products. Our research focus on the detection of target sequence via CRISPR / Cas12a system. LbCas12a genome sequence was synthesized, the endonuclease Xho I and EcoR I were used to digest the empty plasmid, then recombined the target fragment and linear plasmid. The plasmid was chemically transformed to DH5α with pET28TEV. Double enzyme digestion were performed to identify the recombinant product, and pET28TEVLbCas12a plasmid was transformed into the expression vector E. coli BL21 as complete prokaryotic expression. The project has initially completed the construction of LbCas12a protein expression vector and the expression and purification of LbCas12a protein. In our purpose, LbCas12a will be used as a labeling tool in downstream nucleic acid detection as more effective tools and applications.
KEY WORDS：CRISPR / Cas；Cas12a；prokaryotic expression；purification of protein新型冠状病毒疫情爆发给人类带来巨大的威胁，同时也敲响了生物安全的警钟，快速准确地进行病原检测对于防控疾病发生、保障人类健康具有重要意义。在琼脂糖凝胶电泳、胶体金标记技术[1]、高通量测序[2]等已有病原检测技术的基础上，研究者进一步探寻敏感性高、特异性强、成本低，检测效率高、有效可靠的病原检测方法。CRISPR基因编辑标记技术近年来报道应用于微生物的检测中[3]，课题以Cas12a蛋白为出发点，拟建立CRISPR/Cas12a基因编辑体系，结合核酸扩增技术，编辑修饰核酸产物，配合核酸探针鉴定扩增产物，并将该体系应用于病原检测的临床实际中。
CRISPR/Cas12a基因编辑体系可面向不同的双链DNA病原，具有较宽的病原检测范围，配合聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）、重组酶聚合酶扩增技术（Recombinase Polymerase Amplification,RPA）[4,5]、环介导等温扩增技术（Loopmediated Isothermal Amplification，LAMP）[6,7]等多种核酸扩增技术，并有望建立一系列高特异性、高敏感性、有效可靠的检测方法，为病原检测方法和临床实际应用提供更多的机会与可能。

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