目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words2
引言2
1.材料与方法5
1.1实验动物组织样品采集5
1.2MARK4基因的全长cDNA克隆5
1.3生物信息学分析6
2.结果与分析7
2.1猪Mark4基因cDNA全序列的分子克隆7
2.2猪Mark4基因序列生物信息学分析10
2.2.1猪Mark4理化性质和蛋白结构域分析10
2.2.2猪Mark4蛋白二级和三级结构预测分析12
2.2.3猪Mark4蛋白同源性比对分析 14
3.讨论18
致谢18
参考文献19
猪MARK4基因全长cDNA克隆及生物信息学分析
摘要
本研究旨在对猪MARK4基因的全长cDNA进行分子克隆，并通过生物信息学手段分析猪MARK4基因序列结构特征。通过5 和3 端扩增，我们得到猪Mark4基因cDNA序列全长3216 bp，开放阅读框ORF为2259 bp，编码752个氨基酸。通过对猪Mark4基因编码区开放阅读框序列ORF，猪Mark4蛋白氨基酸序列，猪Mark4蛋白分子量，等电点和蛋白功能结构域进行分析，我们得到猪MARK4蛋白分子量(MW)为82535.70 Da，等电点(PI)为9.70。该氨基酸(AA)序列包含多个保守的功能位点，包括一个质子受体(Asp181)、一个蛋白激酶ATP结合区域特征(IIe65Lys88)、一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性位点特征(IIe177Leu189)和一个蛋白激酶结构域(Tyr59IIe310)。根据在线SABLE程序预测的结果，MARK4蛋白的二级结构为13个a螺旋、13个p链和26个螺旋。多重比对和系统发育分析表明，猪Mark4蛋白与其它高等脊椎动物的MARK4蛋白具有较高的同源性(95%99%)。
引言
MAP/微管亲和力调节激酶4(Mark4)属于丝氨酸/苏氨酸激酶家族，磷酸化微管的相关蛋白(Map)，使其脱离微管，从而增加微管动力学、 促进细胞分裂、细胞周期控制、细胞极性测定、细 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ^351916072# 
胞形态改变等。Mark 4基因编码两个相互剪接的异构体L和S，它们的C端区域不同。这些亚型在包括中枢神经系统在内的人类组织中存在差异。MARK4L是一个由752个碱基组成的多肽，它分为三个不同的结构域：(1)蛋白激酶结构域(59314)，(2)泛素相关结构域(322369)，(3)激酶相关结构域(703752)加上54个碱基(649703)参与酶的正确折叠和功能。此外，6573碱基区域被认为是ATP结合区，位于第88位的Lys被认为是ATP结合位点。Asp 181被认为是由Thr 214侧链磷酸化激活的Mark4的活性位点。MARK4S亚型在正常脑组织中高表达，可能参与神经元分化。另一方面，MARK4L在肝癌细胞和胶质瘤中表达上调，提示MARK4L参与细胞周期。一些生物学功能也与Mark4有关，包括微管束的形成、神经系统发育和程序性细胞死亡的积极调节。因此，Mark4被认为是最适合基于结构的合理药物设计的靶点。我们的序列、结构和基于功能的分析应该有助于更好地理解微管动力学调控机制与Mark4相关疾病的研究。
研究表明，Mark4参与多种生理过程，包括调节程序性细胞死亡[1]、细胞增殖[2]、葡萄糖稳态和能量代谢[3]。
人脑胶质瘤
在神经胶质瘤和肝癌细胞系中Mark4L表达的增加揭示了Mark4在癌细胞中功能的重要性。它通过核仁内外的易位参与这些细胞系的构建和维持。科学家在胶质母细胞瘤细胞系中通过杂交技术鉴定了Mark4L的基因组重复[4, 5, 6]。Mark4L在有丝分裂各个阶段可以与中心体共定位。科学家在人脑胶质瘤细胞中也观察到间期期间Mark4L在核仁中的定位，并揭示了胶质瘤细胞系中激酶和中心体畸变之间可能存在的联系[4]。
神经系统发育
在脑缺血后，尤其是海马区，可迅速发现Mark4基因并瞬时上调。与健康大脑相比，许多基因在受伤的大脑中也过度表达，包括使MARK4磷酸化的LKB1。Mark4S在肝细胞中的过度表达会导致细胞活力下降。因此，我们推测，在缺血性事件的早期，MARK4S上调可能会增加神经元死亡的概率。通过竞争性PCR对人、小鼠正常大脑和神经前体细胞的MARK4L和S亚型进行分析，我们发现在神经元分化过程中，MARK4S表达水平升高，而在分化神经元中，MARK4L表达水平保持不变。因此，S亚型被认为是中枢神经系统中神经元特异性的标记物。然而，MARK4L和S蛋白都是通过免疫组化的方式在神经元中表达的，这表明这两种形式在神经元中都扮演着重要的角色[7]。通过分析CNS中最常见肿瘤中19q13染色体的频繁重排，发现了编码MARK4的扩增区域[8]。在这些肿瘤中从未发现该区域被删除，这表明该基因可能对癌细胞很重要[9]
作为治疗肥胖和2型糖尿病的一种新的药物靶点
在这个实验中，研究者研究了通过靶向灭活Mark4基因而产生的小鼠体内能量平衡中的作用。研究者发现，小鼠的Mark4缺陷导致了吞噬力、多动症和代谢亢进，通过对棕色脂肪活动的上调，防止因饮食引起的肥胖及其相关的代谢并发症。因此，Mark4缺乏通过显著增强主要代谢组织中胰岛素刺激的AKT磷酸化来减轻与饮食诱导的肥胖相关的胰岛素抵抗。通过上调关键代谢组织中AMPK激酶的活性和表达，Mark4的消融也显著改善了葡萄糖稳态。综上所述，这些数据确定了Mark4在能量代谢中的关键作用，表明激酶是治疗肥胖和2型糖尿病的一种新的药物靶点。

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