目的 克隆湖羊NR5A2基因3’非编码区序列，并对其miRNA结合位点进行预测，为湖羊NR5A2基因功能的研究提供遗传信息。方法 采集成年湖羊卵巢组织，提取RNA，通过3’RACE方法对NR5A2基因3’非翻译区序列进行克隆并测序，利用miRBase软件对miRNA的结合位点预测。结果 克隆出湖羊NR5A2基因3’非编码区722bp序列，并预测出两个存在于绵羊NR5A2基因的miRNA结合位点，分别为mir-27a和mdo-mir-30c-1。结论 获得湖羊NR5A2基因3’非编码区序列及其miRNA预测结合位点，为进一步研究NR5A2基因3’非翻译区功能及其调控湖羊繁殖机能的作用机制奠定基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1 试验材料与试剂2
1.1.2 主要实验设备2
1.1.3 电泳液及LB培养基的配制2
1.2 方法2
1.2.1 湖羊卵巢RNA提取2
1.2.2 反转录合成cDNA3
1.2.3 3’RACE方法克隆NR5A2基因3’UTR序列3
1.2.4 PCR产物凝胶电泳及回收3
1.2.5 连接4
1.2.6 感受态细胞的转化与培养4
1.2.7 挑菌测序4
1.2.8 miRNA结合位点预测4
2 结果与分析4
2.1 反转录湖羊卵巢RNA4
2.2 扩增反转录产物与鉴定5
2.3 NR5A2基因3’末端非编码区序列扩增6
2.4 PCR扩增产物的克隆与测序6
2.5 miRNA结合位点预测7
3 讨论 8
3.1 NR5A2基因序列的克隆8
3.2 NR5A2基因在各器官中的表达与功能9
3.3 NR5A2基因miRNA结合位点9
致谢10
参考文献10
湖羊NR5A2基因3’UTR克隆及miRNA结合位 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ￥351916072$ 
点预测
动物科学 朱丘仪
引言
孤儿核受体NR5A（nuclear receptor 5A）基因家族由NR5A1和NR5A2组成，在多个物种、多个器官中均有表达。NR5A2又名LRH1（肝脏受体同源物1），在基因表达过程中作为转录激活子调控类固醇基因的表达。在垂体中，NR5A2在前叶中表达，可调控GnRHR、LHβ和FSHβ等多个卵泡发育关键基因的表达。在卵巢组织中，NR5A2还可调控CYP11A1、CYP11A1a、STAR等卵泡发育相关基因的表达。NR5A2基因包含8个外显子及7个内含子，基因总长约为150 kb[1]，其结构域由A/B、C、D、E四个区域组成。3’UTR又叫3’非翻译区，起始于基因序列的编码区的终止子后的第一个核苷酸。3’非编码区可以被一系列调节因子（即反式作用因子）特异性识别，对基因的表达进行调控。miRNA 是一种存在于病毒和高等生物中高度保守的内源性非编码RNA，是一类由高等真核生物基因组编码的18~24个核苷酸组成的非编码单链小RNA分子，它们的靶向序列一般有2～8个核苷酸，通过与mRNA 3非编码区的5端或“seed region”互补结合来调控基因的表达, 从而阻止靶mRNA的翻译或者直接降解靶mRNA[2]。前人研究发现，miRNA381过表达会降低SW480和HCT116细胞中的NR5A2表达，在NR5A2的3非编码区中有miR381的结合位点[3]。Rongfeng Qu等人[4]研究发现，miR374b能靶向结合NR5A2的3非编码区从而调控其表达。而Chunsheng Li等人发现[5]，miR2195p靶向肝脏受体同源物1（LRH1）的3非翻译区，进而抑制LRH1的表达。同时Ran Liu等人发现[6]，miR1395p可通过与NR5A2转录物中特定的3’末端非编码区序列结合而作为转录后抑制因子，下调NR5A2蛋白和mRNA水平。而Zhiyong Li等人[7]的研究发现，miR451靶向NR5A2的3’UTR并调节骨肉瘤细胞中的NR5A2表达。
湖羊是太湖流域重要的家畜之一，也是我国一级保护地方畜禽品种。湖羊不同于我国其他大部分单羔的绵羊品种，是闻名世界的多羔品种，同时是中国特有的羔皮用绵羊品种。湖羊具有四季发情，繁殖率高，适应力强、成熟早等优点[8]。湖羊一年可产两胎，部分羊可达到两年三胎，除初产以外，每胎多数可产2只或以上羊羔，有些产羔数高的可达6～8只。因此湖羊是研究多胎性能及其调控机制的理想对象。首先，绵羊的多胎性与排卵率密切相关。目前已发现的与排卵率相关的主效基因有BMP家族基因如BMPRIB、BMP15[9]和 GDF9基因[10]。同时绵羊的季节性发情也受到主效基因的调控，目前发现的与季节性发情相关的基因有KISS1、D1O3、RFRP3和DIO2基因等[11]。前人在小鼠、斑马鱼、大鼠、鸡、马、青蛙和人体内均有发现NR5A2基因，并发现其在卵巢中有高表达[12]，而关于NR5A2基因与湖羊多胎性相关的研究较少。本研究以湖羊的卵巢为实验材料，利用3’RACE法体外扩增湖羊NR5A2基因的3’非编码区序列，并对miRNA的结合位点进行预测，为今后进一步研究NR5A2基因3’非编码区功能及其在调控湖羊繁殖力相关性状的作用机制奠定基础。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 试验材料与试剂
成年高繁湖羊卵巢（江苏省农业科学院六合实验动物基地羊场）、RNA提取试剂盒（百泰克生物）、胶回收试剂盒（擎科生物）、pMD19T载体的试剂盒（美国Takara生物）、E.coli DH5α感受态细胞（擎科生物）、SMART RACE 5’/3’ Kit（美国Takara生物）、琼脂粉、Tryptone、Yeast extract、NaCl、氨苄青霉素、Loading buffer（擎科生物）、50×DAE Marker（美国Takara生物）。

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