本研究旨在表达厌氧真菌的一种阿魏酸酯酶基因及其突变体，并分析相关酶学特性。试验利用基因组学技术获取了能够在大肠杆菌（DE3）中高效表达的阿魏酸酯酶基因序列，同时分别对阿魏酸酯酶基因序列中编码酯酶及糖苷水解酶的活性位点做定点突变。将酶及其突变体表达后，使用亲和层析、离子交换层析及凝胶过滤法对蛋白进行纯化。多糖类底物降解结果显示，酯酶区突变酶（M1）对多糖类底物的降解能力显著高于野生型阿魏酸酯酶（WT）和糖苷水解酶区突变酶（M2）（P < 0.05）。酯类物质及阿魏酰基低聚糖的降解结果显示，WT的降解能力均显著高于酶M1和M2（P < 0.05）；M1和M2都表现出极低的酯酶活性，且两者间差异不显著（P > 0.05）。综上，本研究成功地表达纯化了厌氧真菌阿魏酸酯酶及其突变体，并发现突变酯酶功能区会显著增强酶对多糖类底物的降解，而突变糖苷水解酶功能区使得酶对酯类物质的降解作用显著下降。
目录
摘要 3
关键词 3
Abstract 3
Key words 3
引言 3
1 材料与方法 4
1.1 材料 4
1.1.1 菌种来源 4
1.1.2 培养基 4
1.1.3 试剂 4
1.2 仪器和设备 4
1.3 方法 4
1.3.1 厌氧真菌阿魏酸酯酶基因序列、氨基酸序列的获取及结构预测 4
1.3.2 试验设计 4
1.3.3 厌氧真菌阿魏酸酯酶基因克隆与表达载体构建 5
1.3.4 厌氧真菌阿魏酸酯酶基因定点突变 5
1.3.5 厌氧真菌阿魏酸酯酶及其突变体的表达纯化 5
1.3.6 阿魏酸酯酶及其突变体对多糖、酯类物质的降解测定 6
1.3.7 阿魏酸酯酶及其突变体催化酯类物质的动力学研究 6
1.3.8 数据统计 6
2 结果与分析 6
2.1 阿魏酸酯酶基因、氨基酸序列及域结构预测结果 6
2.2 阿魏酸酯酶不同功能区的突变与蛋白纯化 8
2.3 阿魏酸酯酶及其突变体对多糖、酯类物质的降 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ^351916072# 
解 8
2.4 阿魏酸酯酶及其突变体催化酯类物质的动力学性质 9
2.5 阿魏酸酯酶的晶体结构 9
3 讨论 10
3.1 阿魏酸酯酶的应用可行性 10
3.2 定点突变对阿魏酸酯酶热稳定的影响 10
3.3 阿魏酸酯酶的酶活力与其结构的关系 11
致谢 11
参考文献 12
一种厌氧真菌阿魏酸酯酶基因的表达及酶学特性研究
引言
引言
饲料被动物采食后，仅依靠自身及肠道微生物的消化还不足以将饲料中的所有组分充分利用，因此需要在饲料中添加特定的酶制剂来提高饲料消化率。因饲料种类和营养成分的差异，所添加的酶制剂种类也不尽相同。阿魏酸酯酶在近年来的研究和应用中越发活跃，其功能主要是断开植物原饲料如粗饲料当中的阿魏酸酯键，使得饲料结构疏松更易被畜禽所消化[1]。阿魏酸酯酶在水解植物纤维组织时，一般与纤维类降解酶协同作用，从而高效降解植物细胞壁组织[2]。因此阿魏酸酯酶在畜牧养殖行业具有较高的应用前景，特别是反刍动物养殖业，为提高饲料转化效率、改善动物生产性能提供了有效手段。
阿魏酸酯酶是羧酸酯水解酶的一个亚类，根据蛋白质序列及催化底物的差异性被分为A、B、C、D四类[3]。自1991年首次从链霉菌olivochromogenes中被表达和鉴定出来后，许多来源于不同细菌和真菌的阿魏酸酯酶被相继分离纯化[4]。真菌来源大多为霉菌等好氧真菌，如黑曲霉阿魏酸酯酶基因一般通过毕赤酵母来克隆表达[5,6]。Liu等[7]从发酵乳酸菌NRRL B1932中克隆出一种未知的阿魏酸酯酶基因并在大肠杆菌中表达，该酶对于人工合成的酯类物质如4硝基苯基乙酸酯表现出极强的酶活。来源于草食动物消化道内的厌氧真菌能够分泌多种高活性的植物细胞壁降解酶，其中也包括阿魏酸酯酶[8]。然而由于厌氧真菌生长条件苛刻，又对氧极不耐受，现今关于厌氧真菌阿魏酸酯酶的表达及酶学特性鉴定还很少。周皓芹等[9]从瘤胃液的真菌系中分离出了一种阿魏酸酯酶，研究发现该酶的最适温度和pH值分别是40 ℃和8.0，且有着很强的稳定性。但这种酶的具体厌氧真菌属来源却是未知的，所以研究具体厌氧真菌属来源的阿魏酸酯酶意义重大，这将有利于挖掘不同菌种来源的阿魏酸酯酶，促进该酶在生产中的广泛应用。
为了进一步满足阿魏酸酯酶的需求，提供更多菌种源的新型阿魏酸酯酶。本试验旨在表达厌氧真菌Pecoramyces sp. F1的一种阿魏酸酯酶，希望挖掘出一些稳定性强、活性高的新型阿魏酸酯酶，为其生产应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种来源 本试验所研究的阿魏酸酯酶基因来自厌氧真菌Pecoramyces sp. F1，为所在实验室已分离菌株[10]。大肠杆菌E.coli（DE3）是购买的商品菌。
1.1.2 培养基 培养基为LB培养基，培养基成分每20 g包含酵母膏5 g，蛋白胨5 g，氯化钠10 g。
1.1.3 试剂 NaH2PO4NaHPO4缓冲液（pH=7.5）、1 M 的异丙基βD硫代半乳糖苷（IPTG）、4羟基苯甲酰肼（PAHBAH）溶液、阿魏酸甲酯（Methyl ferulate）、4硝基苯基乙酸酯（pNPacetate）、阿魏酰低聚糖（FA、FAX、FAXG和FAXX）和4硝基苯酚（pNP）。
1.2 仪器和设备
普通PCR仪、凝胶电泳仪、蛋白质均质器、分离纯化柱、快速蛋白液相色谱仪、液相色谱仪、酶标仪、37 ℃恒温培养箱、高压灭菌锅
1.3 方法
1.3.1 厌氧真菌阿魏酸酯酶基因序列、氨基酸序列的获取及结构预测 在本实验室前期研究基础上，从厌氧真菌Pecoramyces sp. F1中筛选出一个阿魏酸酯酶基因[11]。在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库中输入该酶的DNA序列获得氨基酸序列，同时预测酶蛋白的域结构。参考张圣薇[12]硕士论文描述的ExPasy在线工具的ProtParam软件，预测阿魏酸酯酶的理化参数。使用圆二色性扫描分析比较野生型阿魏酸酯酶及其突变体的二级结构，详细的操作步骤参考Hong等[13]的方法。使用在线网站（http://swissmodel.expasy.org/interactive）预测阿魏酸酯酶的晶体结构。

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