[目的] 获得猪BRE基因的编码区序列，了解其序列特征和编码蛋白性质，阐明BRE基因对猪卵巢颗粒细胞增殖的影响。[方法] 利用PCR扩增和测序技术获得猪BRE基因编码区序列，并进行生物信息学分析；利用双酶切法构建猪BRE基因的过表达载体，瞬时转染至体外培养的猪卵巢颗粒细胞中，使用CCK-8细胞活性检测试剂盒检测细胞的增殖水平,并通过蛋白免疫印迹法检测增殖相关蛋白PCNA的水平。[结果] 猪BRE基因编码区核苷酸序列全长为1152bp，在灵长目、偶蹄目动物中比较保守。猪BRE基因编码蛋白含有383个氨基酸，含有等无规则卷曲和Alpha螺旋等结构域。猪BRE蛋白是一个疏水性蛋白。测序证实猪BRE基因的过表达载体pcDNA3.1-BRE构建成功，且在猪卵巢颗粒细胞中高效表达。CCK-8细胞活性检测发现BRE过表达组猪卵巢颗粒细胞增殖水平在72 h极显著升高；免疫印迹检测结果表明BRE过表达组卵巢颗粒细胞中增殖相关蛋白PCNA的表达水平显著升高。[结论] BRE基因在进化过程中比较保守，能够促进猪卵巢颗粒细胞增殖。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1实验动物 2
1.2总RNA的提取和反转录2
1.3 PCR扩增和测序3
1.4生物信息学分析3
1.5过表达载体的构建3
1.6猪卵巢颗粒细胞培养和转染3
1.7荧光定量PCR4
1.8蛋白免疫印迹4
1.9 CCK8细胞活力检测4
1.10 统计分析4
2结果与分析4
2.1 猪BRE基因编码区的扩增与测序4
2.2 猪BRE基因编码区核苷酸序列分析5
2.3 猪BRE基因编码区氨基酸序列分析6
2.4 猪BRE蛋白结构预测7
2.5 猪BRE基因过表达载体构建9
2.6 BRE基因对猪卵巢颗粒细胞增殖的影响9
3讨论 10
致谢10
参考文献11
图1 猪BRE基因编码区扩增凝胶电 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ^351916072* 
泳5
图2 猪、人和绵羊BRE基因编码区序列比对6
图3 猪BRE基因基因氨基酸序列分析7
图4 猪BRE蛋白二级结构分析8
图5 猪BRE蛋白三级结构分析8
图6 猪BRE过表达效率的验证9
图7 过表达BRE对猪卵巢颗粒细胞增殖的影响9
表1 PCR扩增引物序列2
表2不同物种间BRE基因编码区序列同源性分析5
表 3 不同物种间BRE基因氨基酸同源性分析 8BRE基因在猪卵巢颗粒细胞增殖中的作用
动物科学 方健
引言
引言 卵泡的正常发育决定了雌性动物的排卵数，因而也是影响雌性动物繁殖力的关键因素[1]。卵泡发育的阻滞或者闭锁以及繁殖力低是决定畜牧业效益高低的主要限制因素。众所周知，卵泡是由卵母细胞、卵丘细胞、颗粒细胞以及卵泡膜组成的[2]。卵巢颗粒细胞是哺乳动物卵泡中最重要的体细胞，在卵泡发育、卵母细胞成熟、排卵和母畜的妊娠等过程中起着至关重要的作用。伴随着卵泡生长和发育，颗粒细胞体积增大、数量增多及逐步分化，逐渐成熟[3]。经研究发现，颗粒细胞的增殖对卵巢的卵泡发生、卵子生成、类固醇生成和血管生成等复杂的生物学过程中有着重要影响[47]，同时颗粒细胞还参与了原始卵泡的募集、选择、闭锁、排卵和黄体溶解[810]。因此，卵巢颗粒细胞的正常增殖是雌性生殖活动所必需的。
哺乳动物卵巢颗粒细胞的增殖受到多种因子的调控。研究表明，性腺激素（如促性腺激素（FSH）和促卵泡素（LH））以及类固醇激素（如雌激素）都是维持卵巢颗粒细胞增殖的重要激素[11]。一些重要的细胞生长因子（如IGF1以及TGFβ1）也被证明参与到卵巢颗粒细胞增殖的过程之中[12]。一些调控卵巢颗粒细胞增殖的关键信号通路也被陆续的发现，如WNT信号通路以及NOTCH信号通路等[13, 14]。近年来，越来越多的研究开始关注miRNAs在卵巢颗粒细胞增殖中的调控功能，如miR204、miR9以及miR93[1517]。除此之外，卵泡液微环如氧化应激或者内质网应激对卵巢颗粒细胞造成的损伤也能够使得细胞的增殖水平受到抑制，在小鼠卵巢颗粒细胞中发现氧化应激对颗粒细胞增殖的调控主要是通过FoxO1蛋白入核作用来介导的[18]。褪黑素为一种有效的自由基清除剂与抗氧化剂，在人、小鼠、猪以及绵羊的颗粒细胞中都发现褪黑素能够拮抗应激诱导的细胞增殖的抑制作用[1921]，说明氧化应激的产生和清除对于维持卵巢颗粒细胞正常的增殖水平有着重要的作用。
BRE（brain and reproductive expression）基因是一种应激反应调节基因[22]，广泛分布于不同种属的各种生物以及生物体的多种组织器官中，且在神经和生殖系统的组织器官中高度表达[23]。BRE基因编码蛋白高度保守，定位于细胞质与细胞核中，暗示BRE可能具有多种调控模式[24]。研究表明，BRE在细胞应激的过程中主要参与DNA损伤的修复以及对细胞凋亡的有着抑制作用。在炎症应激反应过程中，BRE蛋白能够直接与肿瘤坏死因子受体（TNFR）相互作用，抑制NFκB信号通路的激活，进而促进肿瘤细胞的增殖[25]； BRE还可抑制死亡受体Fas介导的线粒体凋亡通路的激活[26]。在肺癌细胞中敲减BRE会诱导抗凋亡基因XIAP（Xlinked inhibitor of apoptosis）表达的下调，从而诱导细胞凋亡的发生[27]。在DNA损伤过程中，BRE能够与BRCA1/2协同参与损伤修复，一方面，BRE有助于BRCA1A损伤修复蛋白复合体的形成[28]；另一方面，BRE能够招募去泛素化酶USP7，稳定周期相关蛋白CDC25A，从而维持调节肿瘤细胞的生长[29]。在小鼠卵巢中，敲除BRE会导致卵巢发育缓慢，卵泡发育受阻且卵泡闭锁增加，同时颗粒细胞增殖水平受到抑制[30]。另外，有研究表明BRE同样可以调控类固醇激素的水平[31]。
BRE基因在各种生命活动中的作用复杂多样，但关于其在猪卵巢颗粒细胞的研究较少，至今尚未阐明BRE在猪卵巢颗粒细胞中的具体作用。本文拟分离猪BRE基因序列，了解猪BRE基因和编码蛋白的特征，预测其可能的作用和作用机制；构建猪BRE基因过表达载体，在体外培养的猪卵巢颗粒细胞中，分析其细胞增殖的影响，为阐明BRE在猪卵泡发育和繁殖性状调控中的功能提供科学依据。
1 材料与方法
1．1 实验材料
实验所用动物为商品大白猪母猪，从江苏省南京市天环屠宰场采集其新鲜猪卵巢。提前准备37 ℃的生理盐水，母猪被屠宰后，立即采集其双侧卵巢，并将其放置于生理盐水中，在2 h 之内带回实验室并进行后续操作。

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