在小鼠睾丸中，支持细胞为精原干细胞（SSCs）提供微环境，调节SSCs的命运。其中，雄激素通过GDNF因子调控SSCs分化的作用机制尚未被揭示。本研究首先分离小鼠支持细胞，并通过细胞免疫荧光方法鉴定细胞纯度达76%；然后在体外培养的支持细胞中过表达AR蛋白，发现Gdnf mRNA表达降低；最后将SSCs与过表达AR的支持细胞共培养，发现SSCs表面标记物PLZF表达降低。综上所述，我们初步推测，AR通过负向调节Gdnf进而抑制SSCs自我更新。本研究将为揭示支持细胞调节SSCs发育机制提供参考。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1材料与方法2
1.1实验材料2
1.1.1实验动物2
1.1.2主要试剂2
1.1.3主要仪器和器械3
1.2实验方法3
1.2.1 Sertoli细胞分离培养3
1.2.2 Sertoli细胞纯度鉴定3
1.2.3 细胞转染3
1.2.4 细胞RNA提取3
1.2.5 RTPCR3
1.2.6 Sertoli细胞与SSCs共培养4
2结果与分析5
2.1 Sertoli细胞纯度鉴定5
2.2 转染AR过表达质粒后Sertoli细胞中GDNF表达变化 6
2.3 共培养体系中AR过表达后PLZF表达变化7
3讨论8
致谢10
参考文献11
支持细胞中雄激素受体与Gdnf基因对精原干细胞的调控研究
引言
引言
哺乳动物精子发生是一个十分高效又高度受控的过程，它包含有丝分裂和减数分裂等复杂过程，涉及到繁杂的基因表达调控过程，包括转录、翻译后RNA与蛋白质水平的调控，任何一个环节的出错都有可能导致雄性动物不育。其中，作为曲精细管内唯一与生精细胞接触的体细胞，Sertoli细胞从分化成熟开始，就对生精细胞的发育和分化起着关键的调控作用[1]。一方面，Sertoli细胞在结构上对各级生精细胞起着机械支持 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: #351916072# 
的作用，它所构成的血睾屏障使近管腔部的微环境有利于生精细胞的分化和发育，避免生精细胞发生自身免疫反应；同时能够合成、运输许多促进、协调睾丸功能的营养物质，分泌参与生精细胞分化成熟的细胞因子，保证精子的发生正常且有序地进行。另一方面，支持细胞能够吞噬、消化精子形成过程中脱落在管腔内的残余胞质和发育过程中部分退化或畸变的生精细胞，维持正常发育生精细胞的比例和曲精细管管腔内环境的稳定。
研究表明，有很多Sertoli细胞功能特异性基因的表达或作用发生改变时，都会严重影响到精子发生过程[26]，雄激素受体（androgen receptor, AR）和胶质细胞源性神经营养因子（glial cell linederived neurotrophic factor, GDNF）正在此列。
雄激素在男性的个体发育、生长和生殖功能中起着至关重要的作用，如诱导分化、第二性征的形成和维持、精子发生的启动和维持以及垂体激素分泌的反馈调节等。雄激素的生物活性必须由其细胞内的受体AR所介导，国外学者研究表明，山羊和大鼠睾丸内Sertoli细胞的AR免疫染色强度随着年龄增长不断增强，在性成熟期达到峰值[78]。而在小鼠睾丸中，AR不仅表达于支持细胞、肌样细胞与间质细胞，同时也表达于精原细胞[9]，因此雄激素除了对精原干细胞（spermatogonial stem cells, SSCs）产生间接作用外，也可能产生直接作用，这一现象对于使用添加或去除雄激素的方法研究Sertoli细胞对SSCs的调控产生了一定的干扰。此外还有研究证明，雄激素一方面可促进Sertoli细胞产生分泌GDNF等细胞因子，维持SSCs的自我更新，另一方面能够以Sertoli细胞为介导，间接引起SSCs的分化，促使其减数分裂和成熟，即促进精子发生过程[10]。显然雄激素对于生殖细胞直接和间接的调控仍然存在着许多争议，其内在的分子调控机制亦有待研究。
由睾丸Sertoli细胞产生的GDNF是最早明确的调控SSCs在体内外维持和自我更新的信号分子[1112]，有研究资料证明，GDNF通过旁分泌途径参与了SSCs增殖和分化的调节[13]。由小鼠的体内实验结果可推断，低剂量的GDNF导致SSCs的过度分化和耗损，而与之相反的，高剂量的GDNF将使SSCs趋向于自我更新并抑制其分化[14]。除了直接作用于SSCs，GDNF还可通过自分泌方式促进Sertoli细胞的成熟和增殖，从而促进睾丸发育；亦可加快血睾屏障的形成，及时构建起SSCs的微环境，以此间接调控SSCs的命运。
当下AR和GDNF在生殖系统方面的研究均已取得了一定进展，但仍存在着一系列问题。在生殖领域，大部分研究聚焦于GDNF的信号通路以及与其他细胞因子的协同与拮抗，而其与AR之间的互作研究却少见报道。以往对于GDNF的研究主要集中于将其作为SSCs体外培养组分，然而，蛋白质水平的研究难以实现分析相关基因的作用机制的目的。
目前，小鼠SSCs体外培养技术已相对成熟，但主要是用有限系的胚胎成纤维细胞（MEF）和STO细胞作为饲养层[1517]或者无饲养层体外培养[18]，这几种培养方式与体内环境差异较大，虽然能够维持SSCs体外培养，但不适合用来研究Sertoli细胞中AR与GDNF对精原干细胞的共同调节。对照试验发现，小鼠的精原干细胞以Sertoli细胞为饲养层比以STO为饲养层存活率更高，且存活时间更长[19]。
本实验通过体外培养Sertoli细胞研究AR与GDNF的关联性，以及对精原干细胞的调控。具体表现为分离培养小鼠Sertoli细胞，通过转染AR过表达质粒调节Sertoli细胞中GDNF的表达，并建立Sertoli细胞与SSCs的共培养体系，利用分子生物学手段初步鉴定在AR过表达所引起的GDNF表达变化下SSCs命运的改变。研究AR过表达Sertoli细胞中GDNF的表达，与对SSCs的作用，以及三者之间的关系，对于研究SSCs命运决定的调控，揭示精子发生过程中的分子调控机制，甚至发现新的男性不育治疗方法都有着不同寻常的意义。

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