热应激不但会降低奶牛产奶量，还会影响牛奶成分，这对我国乃至全世界奶牛养殖业发展都造成严重危害，并带来严重的经济损失。其中，奶牛乳腺的基本组成单位是腺泡，而腺泡的分泌情况则反映了奶牛的产奶能力。在本实验中，我们对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞进行热处理，通过使用iTRAQ技术比较正常组和热处理组乳腺上皮细胞蛋白组表达的差异，从而了解热应激对奶牛乳腺上皮细胞与泌乳相关基因蛋白表达水平的影响。与对照组相比，热处理组中共鉴定出271个差异蛋白，其中104个蛋白表达上调和167个蛋白表达下调。对这些差异蛋白进行GO功能性分类后，我们发现大多数差异表达的蛋白与细胞-基质连接组装，分解代谢过程和代谢过程有关。这些蛋白表达的显著变化对乳汁合成及牛奶成分有一定影响，比如对乳蛋白和乳脂肪合成造成影响。之后我们纤溶酶原激活物-纤溶酶原系统蛋白表达的变化会导致β-酪蛋白表达的降低，这进一步支持了热应激对奶牛乳腺上皮细胞泌乳功能有所影响的观点。研究结果还发现热应激导致脂肪酸合成酶的降低，这一结果可以部分解释热应激下奶牛乳脂合成能力降低的原因。本研究明确了热应激对奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白种类的变化及乳脂肪合成的影响，为进一步研究高温对奶牛产奶影响的机制及改善奶牛热应激的措施提供了线索。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）2
1材料与方法2
1.1材料与试剂 2
1.2材料与方法 2
1.2.1奶牛乳腺上皮细胞的获取2
1.2.2 奶牛乳腺上皮细胞的纯化、培养、鉴定及处理3
1.2.3蛋白质的提取与纯化3
1.2.4 iTRAQ标记及高效液相色谱法分离肽段3
1.2.5 ELISA分析培养液中的相关蛋白含量4
1.2.6 Western blot 检测酪蛋白和脂肪酸合成酶的表达4
1.2.7 LCMS/MS 质谱检测与数据处理4
1.2.8 生物信息学和注释4
1.2.9 数据的分析和处理5
2 结果与分析5
2.1蛋白质组学分析结果概述5
2.2对照组和热处理奶牛乳腺上 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ^351916072# 
皮细胞差异蛋白的鉴定5
2.3与泌乳相关蛋白表达的验证7
3 讨论 7
4 小结 8
致谢9
参考文献9
热应激对奶牛乳腺上皮细胞泌乳相关基因表达的影响
引言
热应激是指动物在高温环境下，机体为了维持体温平衡时的一种非特异性免疫应答的防御状态[]。对于奶牛，热应激则体现得更为明显。而近年来，全球气候变暖加速，全年高温天气平均天数逐年变多，热应激对奶牛产奶影响逐渐扩大，对我国乃至全世界奶牛养殖业发展的影响不断加剧，并造成相关行业的巨大经济损失[]。
许多研究表明，夏季高温时奶牛易受到热应激的影响。从营养方面来看，奶牛热应激时食欲下降采食量减少，且消化率下降，有效物质食入更少，致使机体在基础消耗增大下更营养物质摄入不足，需通过增加体内糖、脂肪等物质转化和蛋白质的代谢来为机体提供能量，从而缓解热应激对机体所带来的危害[][][]；在代谢功能和免疫系统方面，热应激会使机体内分泌失调，造成原有代谢紊乱，进而奶牛免疫力及抵抗力下降，疾病易感风险性增加，机体长时间处于非稳态[]；在繁殖性能方面，热应激会影响内分泌轴、生殖激素轴等多轴调控，进而使生殖激素分泌紊乱，造成的机体代谢紊乱，使奶牛的繁殖率下降，从而影响泌乳期奶牛的泌乳能力[]。以上多个方面都说明了在夏季高温下，热应激会影响奶牛的生理稳态，来降低奶牛产奶量[]。但如今研究，大多是以热应激对奶牛生理及免疫能力等影响方面进行探讨，而在热应激对奶牛乳腺泌乳功能的影响方面还缺乏一定了解。另外，大多研究者是通过在体外对奶牛乳腺上皮细胞来进行一定处理，进而开始研究热应激对其生理方面的影响。本研究正是通过在已建立的奶牛乳腺上皮细胞模型上，来探究热应激对奶牛乳腺泌乳相关基因表达的影响，为了解热应激条件下乳腺的分泌情况提供理论基础，进而来丰富热应激对奶牛产奶性能下降的相关研究。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
实验材料：细胞培养液（DMEM，含4.5mg/ml葡萄糖的改良培养基）、10%胎牛血清、胰蛋白酶均为美国Gibco公司产品，1%抗生素抗真菌液、角蛋白18（上皮细胞特异性标记物）、丙酮（HPLC级） 均为美国SigmaAldric公司产品。
目录
实验仪器：超净工作台、电热恒温CO2培养箱（美国Thermo）、超低温冰箱（美国Thermo）、电热恒温水浴锅、细胞培养用倒置显微镜（CKX41，日本Olympus）、真空离心浓缩仪（美国Speedvac）、冷冻离心机（5415R型，德国Eppendorf）等。
1.2 材料与方法
1.2.1 奶牛乳腺上皮细胞的获取
在江苏省丹阳市牛屠宰场进行本次的细胞获取。随机收集3头泌乳后中期奶牛作为本次实验样本，以规范操作取具有完整机能并健康的奶牛乳腺组织，并将其置于恒温的无菌PBS溶液中，带回实验室备用。将采集的乳腺组织用酶消化法获取乳腺上皮细胞，并对乳腺上皮细胞进行分离和纯化，其步骤如下：第一步将处理好的乳腺组织，用含有双抗的 PBS 液及灭菌的DHanks液反复冲洗后，放置于消毒完毕的超净台中。同时备好消毒过的操作器械，打开风箱，点燃酒精灯，使实验中减少细菌的影响；第二步用剪刀、镊子等器具将乳腺中的乳白色腺泡组织小心剥离，剪出组织块大小约1mm3，再用含有双抗的 DMEM 培养液进行反复冲洗进行过渡后，并浸入DMEM 完全培养基（含10%胎牛血清、200U/mL青链霉素）中，然后用吸管吸取组织块后，在培养瓶中进行紧密均匀地接种，每小块之间的距离为0.5cm左右，并在每块组织上滴一滴生长液；第三步把培养瓶置于含有5% CO2的培养箱中倒置培养6h。再在12h 后加入足量（将组织块完全浸没程度）的完全培养基，后持续进行常规培养，每48h 换液1次，待细胞密度达90%左右时，需更换为无血清培养液，用0.25%胰蛋白酶、0.15%胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）去除细胞，再进行接下来的处理。
1.2.2 奶牛乳腺上皮细胞的纯化、培养、鉴定及热处理
纯化环节：从恒温培养箱中取出原代细胞培养瓶，倒掉培养基后，用含有双抗（200 U/mL）的PBS液冲洗培养瓶3次，并使用胰蛋白酶处理细胞，在显微镜下观察，发现混杂的成纤维细胞开始变圆时，立即用DMEM完全培养基终止其反应，待成纤维细胞消失；培养环节：反复吹打并弃去上淸，用PBS冲洗2次后，再用 DMEM 冲洗1次并加入完全培养基继续进行传代培养，重复此过程3至4次；鉴定环节：通过免疫组化实验对乳腺上皮细胞进行鉴定，其中用角蛋白18作为上皮细胞特异性标记物来进行免疫荧光检测，检测出角蛋白18的表达则可证明其为奶牛乳腺上皮细胞。用倒置显微镜对其观察并拍照留底，分析并发现其纯度>95%后说明奶牛乳腺上皮细胞的纯化、培养成功，可用于后续试验。

原文链接：http://www.jxszl.com/yxlw/dwyx/562394.html