PCV2引起的猪圆环病毒病及其相关疾病在我国猪病中占的主导地位愈发明显，受其影响的国家和地区越来越多，给世界养猪业造成了巨大的经济损失，所以研究该病的防控措施是全兽医工作者关注的热点问题。本课题通过将一株PCV2细胞毒接种于无污染的PK-15细胞，连续培养11代，观察细胞生长状况，提取每代病毒DNA，用PCR方法初步鉴定病毒传代情况，用荧光定量PCR方法定量检测每代的病毒拷贝数，用PCR扩增出这株PCV2毒株的特异性全长目的片段，测序并进行同源性及系统进化树分析。结果表明这株PCV2毒株可以在PK-15细胞上连续传代，但由于细胞培养液及操作等原因，导致不同代次之间病毒拷贝数起伏较大。全基因组同源性及系统进化树分析结果表明这株PCV2毒株全基因组长度为1767bp，与塞尔维亚NIVS-5毒株（GenBank登录号HQ378160）的核苷酸同源性最高（98.6%），同属PCV2b基因型；与丹麦DK1987PMWSfree毒株（GenBank登录号EU148504）的核苷酸同源性最低（94.7%）。ORF2推导的氨基酸同源性比较结果表明此株PCV2毒株的ORF2阅读框含有702个碱基，编码233个氨基酸；与PCV2b基因型亲缘关系最近，与PCV2b HQ378160毒株ORF2推导的氨基酸序列同源性为99.1%；与PCV2c基因型亲缘关系最远，与PCV2c EU148503毒株ORF2推导的氨基酸序列同源性仅为88.0%；ORF2推导的氨基酸存在3个变异度较高的主要区域52位-91位、121位-134位、200位-215位，其他位置变化不大。研究结果为江苏省PCV2的流行病学、遗传变异、毒力特性及防控研究提供了参考资料。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1材料与方法2
1.1 材料2
1.1.1 PCV2毒株2
1.1.2 PK15细胞2
1.1.3 阳性对照2
1.1.4 主要试剂2
1.1.5 主要仪器2
1.2 方法 3
1.2.1 PK15细胞培养3
1.2.2 病毒的接种3
1.2.3 病 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ^351916072^ 
毒的培养与收获3
1.2.4 病毒DNA提取3
1.2.5 PCV2传代病毒的PCR检测3
1.2.6 PCV2传代病毒的荧光定量PCR检测4
1.2.7 PCV2全基因组序列的测定与分析4
2结果与分析5
2.1病毒培养5
2.2 PCV2传代病毒的PCR检测6
2.3 PCV2传代病毒的荧光定量PCR检测6
2.4 PCV2全基因组的扩增8
2.5 PCV2全基因序列分析9
2.5.1 核苷酸序列同源性比较9
2.5.2 核苷酸序列系统进化树分析9
2.5.3 ORF2推导的氨基酸序列同源性比较10
3讨论 12
致谢13
参考文献13
猪圆环病毒2型的细胞传代培养及全基因序列分析
引言
猪圆环病毒（Porcine Circovims，PCV）是迄今发现的最小的动物病毒[1]，是一种无囊膜、单链环状DNA病毒[2],可引起猪的多种疾病。现已知PCV有猪圆环病毒1型（PCV1）、2型（PCV2）和3型（PCV3）。PCV1为非致病性病毒，PCV2为致病性病毒[3]，其基因组是由一条共价结合形成的闭环状单股负链组成,全基因组长1766 bp1768 bp；PCV3是最新发现的型[4]。
目前，在我国猪病中占主导地位的为PCV2及其相关性疾病，包括断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）、猪皮炎与肾病综合征（PDNS）、猪呼吸道疾病综合征（RDC）、猪先天性振颤等疾病[5]，PCV2与猪群中发生的多种疾病相关。根据欧盟猪圆环病毒病委员会的分类方法，PCV2型可以分为PCV2a、PCV2b和PCV2c三种基因亚型[69]；2010年，Guo等[10]首次报道PCV2d基因亚型，与PCV2b不同的是，PCV2d亚型Cap蛋白羧基端多了一个赖氨酸（K）。此后，在其他国家和地区也有检测到PCV2d基因亚型的报道[1113]。2015年，Xiao等[14]和Franzo等[15]分别将GenBank中的PCV2序列进行分析，并将PCV2分为4个基因亚型：PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d，并被大家认可。而PCV2a和PCV2b毒株又分为2A、2B、2C、2D、2E、1A、1B和1C八个基因亚群。我国目前PCV2分离株多属于PCV2b和PCV2d亚型，PCV2b和PCV2d已成为近年来国内流行毒株的优势基因型[16]。本课题研究对象为一株从江苏省分离到的PCV2b毒株，旨在通过对已初步适应PK15细胞的一株PCV2b毒株进行传代培养，采用PCR及荧光定量PCR的方法对不同代次的病毒进行检测，用特异性引物扩全长，测序，对其全基因组序列进行核苷酸和氨基酸的同源性及系统进化树分析，为江苏省PCV2的流行病学调查、遗传变异分析、毒力特性及疫病防控研究提供参考资料。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 PCV2毒株
经鉴定为PCV1、PCV3、PRV、PPV阴性的PCV2细胞毒株由江苏省农业科学院兽医研究所人兽共患病防控研究室分离、鉴定、保存。
1.1.2 PK15细胞
已复苏且无污染的猪肾上皮细胞系（PK15）由江苏省农业科学院兽医研究所人兽共患病防控研究室提供。
1.1.3 阳性对照
PCV2阳性DNA由江苏省农业科学院兽医研究所人兽共患病防控研究室保存及提供。
1.1.4 主要试剂
Dulbeccos Modified Eagle Mediun培养液（1×）、胰酶及进口胎牛血清（FBS）均为美国Gibco公司产品；柱式病毒DNAout试剂盒为北京天恩泽基因科技有限公司产品；Master Mix、琼脂粉、DL2000 Maker购自北京擎科新业生物技术有限公司；Rox Reference、Premix Ex Taq为Takara公司产品；TAE电泳缓冲液（25×）、核酸染料为台湾生工有限公司产品。PCV2 P53检测引物、PCV2 N1和PCV2 N2引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；ORF1F、ORF1R、探针P由Takara公司合成，1×1041×108的标准品由江苏省农业科学院兽医研究所人兽共患病防控研究室提供。
1.1.5 主要仪器
QuantStudio 6 Flex RealTime PCR仪为美国Applied Biosystems公司产品；Mastercycler PCR仪、高速冷冻离心机均为德国Eppendorf公司产品；核酸电泳仪购自北京君意东方电泳设备有限公司；全自动数码凝胶成像系统为上海天能科技有限公司产品；CO2培养箱为上海宝赛生物科技有限公司产品；电热恒温培养箱为上海新苗医疗器械制造有限公司产品；光学倒置显微镜为重庆光电仪器有限公司产品；生物安全柜购自南京新飞达光电科学技术有限公司；微型离心机由杭州米欧仪器有限公司生产；掌式离心机为海门市麒麟医用仪器厂生产；Mini Shaker MH1为海门市其林贝尔仪器制造有限公司产品。

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