本实验针对来自广东茂名地区的1份犬脑组织病料进行了实验室检查，利用了免疫荧光、PCR鉴定和免疫印迹法鉴定为狂犬病病毒，命名该毒株为MMRV。后利用细胞培养对该病毒进行分离和扩增，再根据GenBank上收录的多种来自中国的狂犬病病毒毒株的全基因组序列，利用生物软件选择合适区域设计并合成特异性引物。从犬脑提取RNA并反转录形成cDNA，在体外进行特异性扩增，通过基因重组技术使目的基因在感受态细胞中表达，筛选出阳性菌落后对其进行DNA的序列测定，编辑成一段长度为11922nt的狂犬病病毒街毒株MMRV的全基因组序列。最后应用生物信息学的理论和方法，利用相关生物软件，与参考基因进行多重序列比对及同源性分析，并对该街毒株的全基因组绘制遗传进化树，进行分子系统发育分析。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
前言2
1.材料与方法3
1.1 实验材料 3
1.1.1 病料样品3
1.1.2 细胞和菌株3
1.1.3 主要试剂及仪器3
1.1.4 主要试剂配制3
1.1.5 扩增基因所用引物5
1.2 实验方法6
1.2.1技术路线 6
1.2.2 病毒分离鉴定6
1.2.3 扩增病毒各基因片段8
1.2.4 PCR产物胶回收9
1.2.5 目的基因连A尾10
1.2.6 连接pMD18T载体10
1.2.7 转化并细菌培养10
1.2.8 阳性克隆鉴定并测序10
2.结果12
2.1 病毒鉴定结果12
2.2 分离片段扩增结果13
2.3 MMRV全基因组序列测定结果14
3.分析14
3.1 分析所用序列14
3.2 MMRV街毒株全基因组序列组成和分析14
3.3 街毒株MMRV系统进化分析15
3.4基因组核苷酸同源性分析18
3.5编码序列氨基酸同源性分析18
4.讨论19
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参考文献22
附录23
狂犬病病毒街毒株全基因组序列测定及特征分析
引言
前言
狂犬病（rabies）是由狂犬病病毒（rabies virus）引起的一种人兽共患的自然疫源性疾病，亦称恐水症，俗称疯狗病。患病动物的咬伤和抓伤是经典的传播途径，病毒可以感染机体的中枢神经系统（central nervous system, CNS），导致进行性、急性、不可逆性的致死性脑脊髓炎，临诊特征是恐水、畏光、焦躁不安等神经兴奋症状和意识障碍，继而局部或全身麻痹而死亡。在组织病理学上，以非化脓性脑炎和神经细胞胞浆内出现内基氏小体为主要特征。几乎感染所有的温血动物，潜伏期长，一旦发病，死亡率几乎是100%[1]。近期有一种称为米尔沃基疗法的昏迷性治疗可以治愈狂犬病，但经过系统认证后仍未当做是治疗狂犬病的有效疗法[2]。狂犬病是一种全球性疾病，全球每年超过59000人死于狂犬病，其中大约95%来自于亚洲和非洲的发展中国家[3]，对于我国而言是一种不可忽视的公共卫生和免疫预防问题。
狂犬病病毒（rabies virus, RABV）属于弹状病毒科（Rhabdoviridae）的狂犬病病毒属（Lyssavirus），是不分节段的单股负链RNA病毒（Mononegavirales）。总体形态呈典型的子弹状[4]。病毒由外壳和核衣壳两部分组成。外壳是双层脂蛋白的囊膜，其表面镶嵌有呈蜂窝状结构的糖（G）蛋白纤突（长810nm），囊膜内侧为基质（M）蛋白。核衣壳直径为40nm，螺旋状结构，由单股RNA与结构蛋白N、P、L组成核糖核蛋白复合体（ribonucleoprotein, RNP），是病毒转录和复制的活性部位[5]。病毒基因组由1192811932个核苷酸组成，基因组3’至5’端依次排列着3’先导序列（3’ Leader）、N结构基因、P结构基因、M结构基因、G结构基因、L结构基因和5’非编码区（尾部序列，Trailer），其中5个结构基因含有5个大的开放阅读架（ORF）,分别编码核（N）蛋白、磷酸化（P）蛋白、基质（M）蛋白、糖（G）蛋白和转录酶大（L）蛋白[6]。按照识别膜糖（G）蛋白的病毒中和抗体（virusneutralizing antibodies，VNAbs）和单克隆抗体的抗原交叉反应情况[7, 8]，狂犬病病毒属可分为4个血清型：血清Ⅰ型，即狂犬病病毒（RABV），血清Ⅱ型，即Lagos蝙蝠病毒（LBV）；血清Ⅲ型，即Mokola病毒（MOKV）；血清Ⅳ型，Duvenhage病毒（DUVV）。根据狂犬病病毒核（N）蛋白基因的研究进展，将狂犬病病毒属分为7个基因型：基因14型与血清ⅠⅣ型相同，即基因1型是RABV（Rabies virus）；基因2型是LBV（Lagos bat virus）；基因3型是MOKV（Mokola virus）；基因4型是DUVV（Duvenhage virus）。基因5型是EBLV1（the European bat lyssavirus1）、基因6型是EBLV2（the European bat lyssavirus2），两者主要在欧洲沿海地区中的蝙蝠分离[9]。
本课题关于RABV分子流行病学的主要内容是运用基因测序技术测定某一毒株的全基因组序列，借助各种生物信息学软件进行比较和分析，从分子水平上研究RABV基因的变异性、病毒毒力、宿主特异性、抗原性等之间的关系，进而确定毒株来源以及相互间的进化历程，能够系统掌握病毒种系发生及其变异规律，本研究首先从发病犬的脑组织中进行病毒的分离与鉴定，研究其培养特性并对其进行培养，之后采取分段RTPCR的方法，对所分离的街毒株进行序列扩增，将获得的各基因片段进行基因重组、分子克隆操作后利用第一代桑格法进行基因测序，将所测的基因片段进行拼接得到一个完整的基因序列。再以生物信息学的理论和方法为基础，利用多种数据库（如NCBI）资源和分子生物学软件分析狂犬病病毒街毒株MMRV的全基因组序列并对其基因组结构进行全面的分析与比较，包括编码区与非编码区的序列比对、结构蛋白基本特性预测与推导氨基酸序列比对、蛋白质表位分析等。本研究的结果可以为狂犬病病毒的分子生物学研究提供丰富的理论资料，为测定病毒序列实验等相关操作提供有价值的指导。

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