猪链球菌是猪的重要细菌性病原，可导致猪的败血症、脑膜炎等，给养猪业的发展造成严重危害。根据其荚膜多糖抗原性的不同，猪链球菌分为29种传统血清型和部分未定型菌株。近年来发现26种含新的荚膜基因簇（NCL）菌株，它作为潜在的病原，目前对其了解十分有限。2017年-2018年在江苏省某地屠宰场共采集扁桃体样品378份，以gdh和recN作为猪链球菌特异性基因进行PCR鉴定，共鉴定出268份阳性样品，总阳性率为70.9％（268/378）。阳性样品进行纯化后分离出猪链球菌单菌落339株。其中传统血清型296株，NCL血清型20株。NCL血清型中NCL-1型分离率最高，分离率为25％（5/20），其次NCL-25型分离率为20％（4/20），NCL-4型与NCL-5型分离率均为15％（3/20），NCL-3、NCL-7、NCL-11、NCL-17、NCL-20血清型分离率均为5％（1/20）。对2018年分离的NCL型菌株进行斑马鱼毒力试验，结果显示其毒力均显著低于猪链球菌2型毒力株SC070731。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1材料与方法2
1.1材料 2
1.2方法 4
2 结果与分析6
2.1猪链球菌阳性率6
2.2单菌落鉴定结果6
2.3 NCL菌株鉴定结果7
2.4斑马鱼毒力试验7
3 讨论 8
致谢8
参考文献9
江苏省某屠宰场猪链球菌新荚膜基因簇菌株分离鉴定
引言
猪链球菌（Streptococcus suis）是猪的重要细菌性病原，可导致猪的败血症、脑膜炎等症状，给养猪业的发展造成严重危害[1]。根据荚膜多糖（CPS）抗原性的差异，猪链球菌可分为多种血清型以及相当数量的未定型菌株。除了传统的29种血清型，近年来，发现了26种猪链球菌新的荚膜多糖相关基因簇（NCLs）。2013年，潘子豪等人从患有急性仔猪脑膜炎的病猪体内分离出了新的猪链球菌菌株，通过凝集试验和多重PCR鉴定发现这种菌株和其他猪链球菌血清型均不同，确定为一种新的猪链球菌变异血清 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: &351916072& 
型（命名为Chz)，其具有强致动物脑膜炎的能力，并且毒力较强[2]。2015年，Zheng等调查了从健康猪分离的78个不可分型菌株，分析其cps基因座的遗传特征发现了8个新的cps位点（NCL），命名为NCL18[3]。2016年，Qiu等通过荚膜基因分型方法分析2013年至2015年间在中国分离的486株分离株的血清型特征，发现276株携带分属于16种NCLs的分离株，其中8种为新的NCLs，命名为NCL916，并且开发了一种快速、经济的多重检测系统，可以同时识别17种NCLs [4]。2017年，Zheng等研究了从加拿大的发病猪中分离的79株猪链球菌菌株发现了4种新NCLs，命名为NCL1720[5]。2018年， Huang等通过凝集试验和全基因组测序分析从35种不可分型的猪链球菌菌株中鉴定出6种新的NCLs,命名为NCL2126，并且开发了多重PCR检测方法以检测NCL2126菌株，研究结果扩展了猪链球菌荚膜多糖基因座和猪链球菌致病特征的遗传多样性[6]。
目前对NCL菌株的病原特性的了解还十分有限，在本研究中我们对江苏省某屠宰场健康猪进行带菌情况监测，定期采集样品进行分离鉴定，并对已鉴定出的NCL菌株进行斑马鱼毒力试验，研究其病原特性。
1 材料与方法
1．1 材料
菌株
本研究所用猪链球菌NCL菌株均为本实验室分离保存，其中12株为2017年从江苏省某屠宰场分离，8株为2018年分离所得。猪链球菌2型毒力株SC070731及猪链球菌9型弱毒株SH040917均为本实验室保存。
1.1.2 试剂与仪器
从南京鼎国生物技术有限公司购买的琼脂糖、Goldview、无菌绵羊血、结晶紫、庆大霉素、萘啶酮酸、氢氧化钠；从南京诺唯赞生物科技有限公司购买的2× Taq Master mix与DL2000 DNA Marker；从美国BD公司购买THB培养基；从Thermo公司购买的PCR扩增仪、离心机、匀浆仪以及从BioRad公司购买凝胶成像系统。
1.1.3 配置选择性培养基
液体选择性培养基：每次配置3瓶，每瓶500mL容量。每100mL去离子水加入3g THB粉末，充分混匀后加入10μL结晶紫母液，溶解后放入高压锅内灭菌。灭菌后冷却至55℃，加入100μL萘啶酮酸母液与10μL庆大霉素母液，待冷却至室温后放入4℃冰箱备用。
固体选择性培养基：每次配置2瓶，每瓶300mL容量。每100mL去离子水加入3g THB粉末、1.5g琼脂粉，充分混匀后加入10μL结晶紫母液，溶解后放入高压锅内灭菌。灭菌后冷却至55℃，加入100μL萘啶酮酸母液与10μL庆大霉素母液，待冷却至合适温度后每100mL加入5mL绵羊血，混匀后快速倒入平板，凝固后紫外灯照射30min，于4℃冰箱倒放保存。
结晶紫母液浓度为12mg/mL。即称取120mg的固体结晶紫，研磨后溶于10ml去离子水中，充分混匀，放入20℃冰箱保存备用。庆大霉素母液浓度为12mg/mL，萘啶酮酸母液浓度为3mg/mL[7]。
1.1.4 引物
分离猪链球菌所用到的gdh、recN引物序列参照文献[8]，鉴定猪链球菌NCL126菌株所用到的引物序列以及Chz的特异性引物序列参照文献。引物从南京金斯瑞生物科技有限公司购买。引物序列见表1。
表1 猪链球菌鉴定所需引物序列
基因名称
引物名称
引物序列
目的片段大小
退火温度(℃)
gdh
gdhF
CCATGGACAGATAAAGATGG
689bp
55
gdhR
GCAGCGTATTCTGTCAAACG
recN
recNF
CTACAAACAGCTCTCTTCT

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