来源于瘤胃内厌氧真菌基因组的四个木聚糖酶基因A11973、A10081、A00840和A00841，属于糖苷水解酶第10家族的木聚糖酶。在本研究中，我们预测了其目的蛋白的结构和理化性质，并将这四株木聚糖酶的基因成功克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a中，构建重组质粒并转化到大肠杆菌BL21（DE3）中得到重组工程菌，经过培养和IPTG诱导表达重组蛋白后，测定四个重组木聚糖酶的比酶活并研究其相应的酶学性质。结果显示，A11973的比酶活为0.0151U/mg，最适反应温度为50℃，最适反应pH为7.0；A10081的比酶活为0.0061U/mg，最适反应温度为60℃，最适反应pH为6.0；A00840比酶活为0.0034U/mg，最适反应温度为60℃，最适反应pH为7.0；A00841的比酶活为0.0061U/mg，最适反应温度为60℃，最适反应pH为7.0。上述特征表明这四个酶在饲料工业等领域有良好的应用前景。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
材料 2
1.2 方法 2
1.2.1 目的蛋白结构及理化性质的预测3
1.2.2 重组质粒的构建3
1.2.3 表达菌株的酶切鉴定3
1.2.4 重组质粒的原核表达3
1.2.5 重组木聚糖酶的诱导表达3
1.2.6 目的蛋白的SDSPAGE电泳鉴定3
1.2.7 木糖标准曲线的制作4
1.2.8 重组木聚糖酶的活性测定4
1.2.9 重组木聚糖酶的蛋白浓度测定及比酶活计算4
1.2.10 温度对重组木聚糖酶活性的影响4
1.2.11 pH对重组木聚糖酶活性的影响4
1.3 统计分析 4
2 结果与分析5
2.1 目的蛋白的结构及其理化性质预测5
2.2 表达菌株的酶切鉴定6
2.3 SDSPAGE蛋白电泳检测6
2.4 木糖标准曲线的绘制7
2.5 重组木 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ^351916072^ 
聚糖酶的比酶活测定7
2.6 温度对重组木聚糖酶活性的影响7
2.7 pH对重组木聚糖酶活性的影响7
3 讨论 8
致谢9
参考文献9
厌氧真菌木聚糖酶基因在大肠杆菌中的表达及酶学性质研究
引言
木聚糖是一种多聚五碳糖，是构成植物细胞壁的半纤维素多糖中重要的组成成分之一，大约占了植物细胞干重的35%，在自然界中的含量仅次于纤维素多糖，是一种重要的、丰富的、可再生的生物资源[1]。但由于其结构原因，木聚糖这一复杂的多糖类物质很难在自然界中被充分地利用[2]。木聚糖酶作为木聚糖降解酶系中最重要的一种，可以充分将木聚糖降解为低聚木糖和木糖，已经在食品、饲料、造纸、医药等多个领域被广泛开发和应用，同时展现出了较大的应用前景和潜力[3]。
反刍动物的瘤胃是一个非常复杂的生物体系，其中有着多样的微生物种类，以及丰富的基因资源[4]。目前通过对瘤胃内部分厌氧真菌研究发现，其产出的木聚糖酶的活性要比工业用的产酶微生物木霉菌等分泌的酶活性要高出很多，这说明了瘤胃中微生物基因资源有很大的开发潜力，有待我们去进一步的挖掘[5]。
根据蛋白质的结构特点、氨基酸序列、底物特异性、作用机制等性质上的不同，木聚糖酶一共可以分为GH5、GH8、GH10、GH11、GH30、GH43等6个糖苷水解酶家族[6]。绝大部分木聚糖酶都属于GH10和GH11家族，其中GH10家族木聚糖酶有着分子质量较大、底物特异性较广泛、等电点较低等特点[7]，使得关于其家族新酶的寻找和开发、结构的设计与改造成为近些年来的研究热点之一。
本研究选取了四个GH10家族的瘤胃厌氧真菌木聚糖酶基因，通过相关软件预测其特性，将目的基因片段进行克隆、质粒连接并转化，得到相应的重组工程菌，对重组工程菌进行诱导后表达重组蛋白[8]，并对其进行SDSPAGE电泳检测，随后对重组的木聚糖酶进行相应的酶学性质研究，包括酶活测定、酶的最适反应温度和最适反应pH测定，为进一步开发瘤胃基因资源，以及研究和改造GH10家族木聚糖酶基因奠定基础[9]。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株与质粒 实验所用大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α、BL21（DE3）感受态细胞、克隆载体pUC57、表达载体pET28a购买于生工生物工程（上海）有限公司，四个木聚糖酶基因由生工生物工程（上海）有限公司合成。
1.1.2 主要试剂 Bradford蛋白浓度测定试剂盒购买于北京索莱宝科技有限公司，胰蛋白胨、酵母提取物购买于南京金益柏生物科技有限公司，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium dodecagonsulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）试剂盒、质粒提取试剂盒、切胶回收试剂盒、菌株构建所用的限制性内切酶（Xhol和Ndel）购买于生工生物工程（上海）股份有限公司，1 mol/L TrisHCL Buffer、卡那霉素、氨苄霉素、异丙基βD硫代吡喃半乳糖苷（Isopropyl βDthiogalactoside，IPTG）、蛋白分子量标准、考马斯亮蓝染色脱色液、SDSPAGE凝胶配制试剂盒购买于上海碧云天生物技术有限公司，燕麦木聚糖底物购于Sigma公司，其他常规生化试剂为国产分析纯。
1.1.3 试剂与培养基的配制
（1）3, 5二硝基水杨酸 (3, 5dinitrosalicylic acid，DNS)试剂：准确称取酒石酸钾钠18.2 g溶于50 mL去离子水中，在45℃水浴中加热。称取3, 5二硝基水杨酸0.63 g加入到26.2 mL 2 mol/L的氢氧化钠溶液中，待完全溶解后，加入已经溶解的酒石酸钾钠溶液，混合均匀后，再加入苯酚0.5 g，亚硫酸钠0.5 g，搅拌至溶解。冷却至室温后用去离子水定容至100 mL。混匀并且过滤，储存于棕色试剂瓶中避光保存，放置一周后使用。

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