噬菌体是感染细菌、真菌、支原体等微生物的一类病毒的总称，其广泛存在于自然界中，数目更可达细菌的数十倍。随着基因组测序技术的迅猛发展，研究发现许多细菌基因组中含有前噬菌体序列，有数据表明噬菌体DNA在细菌基因组比例可高达20%，已有研究发现前噬菌体提高了宿主菌毒力及适应性。本实验室前期研究发现前噬菌体phiv142-3可增强宿主菌DE142的定殖能力和在血清中的存活能力，但具体作用机制尚不明确。本课题首先通过转录组学分析，发现前噬菌体phiv142-3中orf1258和orf1264两基因在血清中表达量较高。进而利用qRT-PCR技术对基因orf1258及orf1264在血清中的表达情况进行了验证，结果表明orf1258的表达量上调了3.3倍（P<0.01），orf1264的表达量上调了4.1倍（P<0.001）。为了研究它们在宿主菌中的作用，本试验利用Red重组系统对这两个基因进行敲除，将野生株与缺失株的生物学特性进行比较后发现缺铁条件下缺失株生长相对缓慢，但与野生株的生长情况无显著差异；氧化条件下缺失株与野生株生长情况亦无显著差异，但缺失株在生长起始即慢于野生株。血清杀菌实验表明在100%血清中，缺失株DE142△orf1258、DE142△orf1264相对存活率较野生株DE142分别下降了19% (P<0.05)和12% (P<0.05)；在50%血清中，缺失株DE142△orf1258、DE142△orf1264相对存活率较野生株DE142分别下降了66% (P<0.001)和37% (P<0.01)。雏鸡体内定殖实验显示缺失株DE142△orf1258和DE142△orf1264在心脏定殖量较DE142分别下降了86.2% （P<0.05）和91.5% （P<0.05）。以上结果表明缺失株在血清中存活能力有所下降。综上，本研究发现orf1258及orf1264对宿主菌DE142在血清中生存起到了促进作用，为加深对APEC致病机制的了解提供了一定的基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words2
引言2
1材料与方法2
1.1材料 2
1.1.1 菌株和质粒2
1.1.2酶和主要试剂3
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1.1.3 培养基3
1.1.4 实验动物3
1.2 方法 3
1.2.1 引物设计3
1.2.2 orf1258、orf1264在血清中表达量检测4
1.2.3 orf1258、orf1264基因缺失4
1.2.4 生长曲线测定6
1.2.5 氧化应激耐受性测定7
1.2.6 血清杀菌实验7
1.2.7 体内定殖实验7
1.2.8 数据分析7
2 结果与分析7
2.1 orf1258、orf1264在血清中表达量检测结果7
2.2 单基因缺失株的获得8
2.3 生长曲线测定结果9
2.3.1 LB条件下生长曲线测定结果9
2.3.2 低铁条件下生长曲线测定结果9
2.4 氧化应激耐受性测定结果9
2.5 血清杀菌实验结果10
2.6 体内定殖实验结果10
3 讨论 11
致谢12
参考文献12
前噬菌体phiv1423 orf1258和orf1264基因对APEC血清存活能力的影响
引言
噬菌体是感染细菌、真菌、支原体等微生物的一类病毒的总称，按其生活周期分类可将噬菌体分为烈性噬菌体和温和噬菌体，整合在宿主基因组中的温和噬菌体称为前噬菌体。其在自然界中广泛存在，数目更可达细菌的数十倍[1]。随着基因组测序技术的迅猛发展，发现许多细菌基因组中含有前噬菌体序列，这些噬菌体DNA在细菌基因组比例可高达20%[2]。在溶源状态下，前噬菌体一方面对细菌造成了额外的代谢负担[3]，另一方面也为细菌带来新的基因。已有研究发现前噬菌体提高了宿主菌的致病力及环境适应性[4]。噬菌体SMP插入猪链球菌SS24基因组后，溶源菌生长速度加快，用斑马鱼动物模型进行实验研究后发现其毒力增强[5];当从大肠杆菌标准株K12 BW25113基因组中移除全部前噬菌体后，菌株生长速度变慢，对环境应激因素的耐受能力降低[6]。
禽致病性大肠杆菌（APEC）是一种肠道外致病菌，可通过呼吸道感染家禽，引起禽类脑膜炎、心包炎、肝周炎等问题，给养禽业的发展带来了不小的阻碍。另外，APEC与引起人类尿路感染的UPEC和引起新生儿脑膜炎的NMEC极为相似[7，8]，这提示其也具有一定的公共卫生意义。而目前对于前噬菌体在细菌中作用的研究与报道较少，因此明确前噬菌体在APEC中的作用不仅可以填补该领域空白，也可以为APEC防治带来新的思索。
Red重组系统是基于同源重组原理的一种基因缺失技术，已被广泛应用于大肠杆菌的基因缺失中。Red重组系统包括来自λ噬菌体Red区的exo、bet、gam3个基因，它们分别编码Exo、Beta、Gam3种蛋白[9]。Exo为双链核酸外切酶，结合在双链DNA末端，从5’向3’方向降解DNA单链[9]；Beta为单链退火蛋白，促进DNA互补链的退火[9]；Gam为Exo、Beta的辅助蛋白，抑制细胞内外源DNA的降解[9]。pKD46可在L阿拉伯糖诱导下表达以上3种蛋白，其携带的氨苄青霉素抗性基因作为筛选标记；pKD4含有两侧带有翻转酶结合位点（FRT）的卡那霉素抗性基因；pCP20表达的翻转酶重组酶（FLP）与FRT位点结合，在FLP作用下，FRT位点自身发生同源重组，从而消除一个FRT位点及抗性基因。
本实验室前期研究发现前噬菌体phiv1423可提高宿主菌DE142在血清中的存活能力及定殖能力，但具体机制尚不明确。本实验通过qRTPCR检测发现，与野生株相比，前噬菌体phiv1423中orf1258和orf1264两基因在血清中表达量有所上调。因此本课题选取orf1258和orf1264两基因为研究对象，利用Red重组系统进行基因缺失，进而对缺失株进行生物学特性分析，以探究这两个基因对DE142血清存活能力乃至致病力的影响。
1 材料与方法
1．1 材料
1.1.1 菌株和质粒
DE142为本实验室保存菌株，从安徽一养殖场患有神经症状的雏鸭脑中分离出的致病株，经鉴定属于O2血清型，B2群(ECOR分群)。
所有菌株都于LB培养基中培养，氨苄青霉素（100 µg/mL）、卡那霉素（50 µg/mL）分别用于培养携带相应质粒的菌株。本实验所用菌株及质粒见表1。
表1 菌株和质粒
Table 1 Bacterial strains and plasmids used in this study
菌株或质粒
特点
菌株
DE142
实验室保藏菌种，分离自鸭大脑组织，O2血清型
DE142△orf1258
orf1258缺失株
DE142△orf1264

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