本试验以营养限制及限制后补饲的湖羊肝脏为对象，通过荧光定量PCR和Western blot等方法检测肝脏组织中Hippo通路核心基因和AMPK蛋白的表达变化。结果发现在能量限制阶段，与对照组相比，能量限制显著降低了湖羊的肝脏重和体重（P < 0.05）；湖羊肝脏组织中Hippo通路核心基因和YAP1蛋白的表达量显著降低（P < 0.05），而AMPK的mRNA和蛋白磷酸化水平显著升高（P < 0.05）。在能量补偿阶段，补偿生长组湖羊的肝脏重和体重、湖羊肝脏组织中Hippo通路核心基因（除 YAP1 外）的表达量和AMPK蛋白的磷酸化水平均与对照组差异不显著。上述结果表明，适当水平的能量限制后补饲对湖羊的生长发育具有补偿生长作用，Hippo通路和AMPK蛋白可能共同参与不同营养水平对湖羊肝脏发育的调节。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 试验设计、饲料组成和试验动物2
1.2 样品采集与处理2
1.3 肝脏组织氨基转移酶活性检测3
1.4 RNA提取、反转录与实时定量PCR检测3
1.5 免疫组化法检测4
1.6 Western blot检测4
1.7 数据的处理与统计分析4
2 结果与分析4
2.1 能量限制与补偿对湖羊羔羊体重的影响4
2.2 能量限制与补偿对湖羊肝脏重和肝脏组织中转氨酶活性的影响5
2.3 能量限制与补偿对湖羊肝脏组织中Hippo通路核心基因表达的影响5
2.4 能量限制与补偿对湖羊肝脏组织中YAP1蛋白表达的影响6
2.5 能量限制与补偿对湖羊肝脏组织中AMPK表达的影响6
3 讨论 7
3.1 能量限制与补偿对湖羊体重、肝脏重及肝脏转氨酶活性的影响7
3.2 能量限制与补偿对湖羊肝脏组织中Hippo通路相关基因表达的影响8
致谢8
参考文献9
补偿生长对湖羊肝脏组织中Hippo通路相关基因表达的影响
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引言 湖羊是我国太湖流域重要的绵羊品种，因其具有适应性强、繁殖力高和四季发情等特点，被引入到全国各地。在湖羊的饲养过程中，饲料资源在春夏季节较为丰富，可为湖羊的生长提供充足的营养物质，但冬季草料相对缺乏、饲草品质下降，会直接影响湖羊的生长发育，易造成羔羊体质瘦弱，使养殖效益未能实现最大化。研究发现，适当水平的营养限制后再补偿，可促进个体的生长发育[1，2]。然而，在我国肉羊的饲养管理中，湖羊的补偿生长能力并未得到很好的重视和利用，并且补偿生长的调控机理尚不完全清楚。因此，研究湖羊营养受限与补偿的调控机理，为科学饲养湖羊提供理论依据具有重要意义。
肝脏是机体重要的消化器官，消化道吸收的营养物质，必须经过肝脏，而后才能进入循环系统，肝脏在外周血液营养物质的组成和代谢的整合调节中起着十分重要的作用[3]。研究显示，营养限制时动物机体会不同程度地动员内脏器官储存的营养物质而维持自身营养需要，其中动员肝脏组织储存的营养物质是内脏器官失重的主要部分[4]。另有研究表明，肝脏参与的能量代谢与动物的生长发育密切相关[5]。在杂交公羊的营养限制试验中发现，营养限制会导致杂交公羊内脏器官生长发育受阻，而影响比较显著的器官是肝脏组织[6]，这可能是因为肝脏是营养物质代谢的主要器官，只有肝脏快速增长才能承担起营养物质的消化、吸收和转化的作用。此外，代谢组学研究发现，能量限制主要通过影响肝脏组织的代谢而参与机体发育的调节[7]；基因组学和蛋白组学研究发现，能量限制也可以通过调控细胞的增殖和凋亡来影响机体器官的发育[8]。但关于能量限制影响器官发育的机制还尚不清楚。
近期研究报道，Hippo通路在参与调节器官大小、细胞周期和凋亡以及维持内环境稳态等方面具有重要的作用[9]；同时也参与机体能量代谢的调节[10]。Hippo信号通路的核心因子主要包括MST1/2（Mammalian sterile 20like protein kinase 1/2）和LATS1/2（large tumor suppressor 1/2），以及效应基因YAP1（Yesassociated protein 1）[11]。有研究发现，长期的饥饿或者营养不足会导致动物器官的发育不良，信号通路感应外界营养水平及细胞因子来调控细胞代谢的研宄较少[12]，例如Yu等研究表明血清饥饿能够提高YAP的磷酸化水平，抑制YAP的转录活性的机理研究[13]。同时Wang等研究发现，能量限制（葡萄糖饥饿）会激活LATS1/2激酶活性，抑制YAP1及其下游基因葡萄糖转运蛋白3的表达，并通过调节能量代谢来参与癌症的发生[14]。DERAN等研究发现，能量限制会激活AMP依赖的蛋白激酶（AMPactivated protein kinase，AMPK，由PRKAA1基因编码）通过诱导YAP1蛋白的磷酸化而参与调节细胞的增殖和能量代谢[10]。此外，本实验室前期研究发现，能量限制能通过调节Hippo信号通路关键基因的表达参与湖羊肝脏组织的发育[15]。虽然关于Hippo信号通路参与能量代谢的研究已有报道，但在个体水平上的研究还比较少，特别是在反刍动物中鲜有报道。因此，本研究以湖羊为对象，探究早期能量限制与后期能量补偿对湖羊生长性能和肝脏组织中Hippo通路相关基因和AMPK表达的影响，为研究反刍动物补偿生长效应的作用机制提供理论依据，对进一步指导生产实践具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 试验动物、日粮组成和试验设计
本试验在江苏省泰州市海伦羊业有限公司进行。选取32只体重相近、体况良好、系谱清楚、相同遗传背景的3月龄湖羊公羔，随机分为两组（对照组和补偿生长组，体重分别为22.39 ± 0.54 kg 和 22.27 ± 0.64 kg，每组16只）。所有试验羊均采用分栏饲养，每天饲喂两次（08:00和16:00），自由饮水。试验日粮营养水平参考《NY 8162004肉羊饲养标准》，配制颗粒饲料，预混料由北京精准动物研究中心提供，日粮组成及营养水平见表1。参考李东等[16]的研究，将试验分为限制饲养（60 d）和补偿饲养（90 d）两个阶段，试验羊在预饲15 d后开始正式试验。能量限制阶段对照组和试验组日粮的代谢能分别为11.64 MJ/kg和6.84 MJ/kg，能量补偿阶段日粮的代谢能为12.86 MJ/kg。试验设计如图1 所示。

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