本试验旨在对猪HOXA11基因启动子区域SNP位点进行筛选，并对筛选出的位点的基因型与样本的肉质性状进行关联分析。试验使用杜洛克×皮特兰×长白×大白四元杂交猪。在HOXA11基因转录起始位点上游1377位发现一个SNP位点，为C>T突变；使用AS-PCR方法对293个样本进行基因型分型，其基因型频率为CC型0.54(158个)，CT型0.37(109个)，TT型0.09(26个)。多因素混合方差分析结果显示，该SNP位点基因型与肉质性状中肌内脂肪含量、肉色值L、肉色值a、肉色值b未发现统计上的相关性；该SNP位点基因型与平均背膘厚显著相关，CC型和CT型显著高于TT型。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words 1
引言1
1 材料与方法2
1.1 试验材料2
1.1.1 试验动物2
1.1.2 主要试剂2
1.1.3 主要仪器设备3
1.2 提取基因组DNA 3
1.3 引物设计3
1.4 PCR扩增和测序3
1.5 SNP位点鉴定4
1.6 SNP分型引物设计4
1.7 ASPCR反应分型4
1.8 数据统计与分析4
2 结果与分析5
2.1 SNP位点鉴定5
2.2 SNP分型的电泳结果5
2.3 SNP位点处基因频率及基因型频率统计6
2.4 SNP位点处基因型与肉质性状的关联分析6
3 讨论6
4 小结7
致谢7
参考文献8
猪HOXA11基因启动子区SNP检测及其与肉质性状关联分析
引言
猪肉是我国市场上最常见的肉类选择之一，也是我国传统上主要食用的肉类之一。随着经济发展与人民群众生活水平的提高，人们对猪肉不再简单满足于足量，对在口感、风味等肉质特性上具有优良水准的肉类的需求也在不断提高，因此，对猪优质肉质性状的选育工作的重要性也不断提升；利用与肉质性状相关联的分子遗传标记可以极大提高选育的效率和准确性，近年来在畜牧业中也 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ￥351916072$ 
逐渐得到了推广应用。
SNP即单核苷酸多态性，主要指单个碱基的改变引起的基因组DNA序列的多态性，大多是二等位突变，主要是单个碱基转换，即嘌呤突变为嘌呤、嘧啶突变为嘧啶，或颠换，即嘌呤突变为嘧啶、嘧啶突变为嘌呤；也可能是碱基缺失或插入突变，相对较少。在育种实践中，使用SNP进行标记辅助选择，相比于QTL定位，可以对单个碱基变异与表型性状进行关联分析，有利于精确定位；且SNP标记遗传稳定性好，多为二等位突变易于分型和数据分析，故使用SNP辅助育种可缩短世代间隔，提高选择强度[1]。例如，徐珍选取猪的FRZB、ABCF1、IGFBP2和BMP3b 基因进行SNP 检测，结果发现FRZB 基因5’端调控区转录起始位点上游532bp 处有一插入型SNP，且该位点与背膘厚性状呈极显著相关；在其他几个基因中也分别发现与出生重、背膘厚、眼肌面积等性状显著相关的位点[2]。另外，在动物研究中，SNP可用于亲缘关系鉴定、个体溯源鉴定及品种溯源鉴定，如Cheong等采用SNP位点组合研究方法将韩国Hanwoo牛同韩产荷斯坦牛、进口牛区分开，为本国牛肉产业实现品种保护[3]。这些结果说明，SNP检测方法在动物研究中具有实用价值，且在动物生产和育种实践中具有一定经济价值。
HOX基因即同源异型盒基因（Homeobox gene, HOX），最早在果蝇身上被发现，在进化上高度保守。HOXA11基因属于HOX基因家族的第一簇（HOXA），猪的HOXA11基因位于其18号染色体上。HOX基因具有调控动物形体发育的功能，包括泌尿生殖系统发育、神经系统发育、附肢发育、肌肉发育等，与多种癌症的发生也具有相关性。其序列均含有约183bp的保守序列，编码60~61个氨基酸构成的多肽区域，称为同源结构域（Homeodomain, HD）；它呈球型折叠，并以螺旋转角螺旋的结构特异地结合DNA，作为转录调控因子调节靶基因的表达而参与各种生物学过程，不同的HD与DNA亲和性也存在不同，是因为HOX基因的产物与靶基因之间存在选择作用[4]。
Haack H等研究发现，肌肉发育过程中，在成纤维细胞生长因子（FGF）和肝细胞生长/分散因子（HGF/SF）的影响下，HOXA11基因在肢体肌肉前体中被诱导并持续性表达，然后从后端到前端的肌肉群中表达逐渐减少[5]。Masakazu Yamamoto等通过卵内电穿孔激活HOXA11基因表达，以确定其在肢体肌肉生成的作用，他们发现在HOXA11基因异常表达的情况下，MyoD的表达被瞬间阻断；而在C2C12成肌细胞中，HOXA11基因的转染也抑制了内源性MyoD的表达[6]。这些结果表明，HOXA11基因通过负调控肢体肌肉前体中MyoD的表达来调节肌肉发育。Colin G. Crist等对依赖MyoD基因家族控制的miRNA进行研究，这些miRNA参与胚胎的肌肉组织发育和成体肌肉再生中成肌细胞分化的过程[7]。除去依赖MyoD的基因家族的miRNA外，另有研究发现miRNA29、miRNA181等miRNA虽然不具备骨骼肌特异性，但是在C2C12成肌细胞中上调，并通过靶向一般转录因子YY1和HOXA11基因的mRNA促进其分化[89]。而又有研究表明，以牛骨骼肌卫星细胞为样本，miRNA181的表达与HOXA11基因的表达呈负相关，而转染miRNA181模拟物后HOXA11蛋白表达水平下降，说明HOXA11是miRNA181的靶基因，而且miRNA181能抑制HOXA11基因的表达，进而诱导MyoD蛋白的产生[10]。Sara de las HerasSaldana等以新生Hanwoo牛的卫星细胞作为研究肌细胞生长的模型，通过时间序列RNAseq鉴定出在背最长肌和半膜肌发育过程中HOXA11等13个基因有差异性表达，可能参与确定肌肉谱系（muscle lineage）过程，并且可能在卫星细胞分化成多核肌管的过程中调节肌源性调节因子，如MyoD和MYF5的表达[11]。在肢芽形成中，Masakazu Yamamoto发现HOXA11的蛋白质产物在肌肉前体细胞中表达，而使用维甲酸作为一种信号分子能使肢芽由桡骨向尺骨转变，在该条件下，HOXA11基因在异常肢芽内的迁移性成肌细胞中被诱导，这些结果表明HOXA11基因的表达受到肢体间充质和极化信号如维甲酸的控制[12]。从上述资料中可以看出，HOXA11基因在肌肉发育过程中起到了相对重要的作用。
本课题组前期深度测序发现，猪HOXA11基因在不同肉质的肌肉中差异表达。结合以上对HOXA11基因与肌肉发育相关调控机制的研究成果，本课题选择HOXA11基因为目标基因，筛选其启动子区域存在的SNP位点，并与肉质性状进行关联分析，以期为猪肉质性状选育提供分子靶标。

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