:本试验将TGEV JS2012株经过3次挑斑纯化在ST细胞上传代至200代, 参考GenBank上的TGEV Purdue毒株（DQ811789）基因cDNA序列, 设计合成5段特异性引物, 对第1代, 第12代, 25代, 50代, 100代, 120, 160, 180代和200代病毒进行PCR扩增, 克隆和测序。应用DNAStar中的SeqMan对病毒S基因序列进行拼接, 得到完整的S基因序列, 与国外2对具有代表性的TGEV强弱毒株S基因序列进行比对。结果显示初代, 12代, 25代的TGEVJS2012与Miller M6和M60同源性高, 处于同一分支, 50代, 100代, 120代, 160代, 180代和200代与Virulent Purdue和Purdue115在一个分支。与初代株相比, 第50至200代之间6个被挑选的TGEV JS2012在S蛋白主要的抗原位点内发生了7个氨基酸位点的突变。本毒株与Purdue毒株非常相似：50代之后被挑选的JS2012毒株和Purdue P115毒株与各自的初代毒株进行比较发现, S基因都有6个碱基的缺失, S蛋白在第375和376缺少2个氨基酸, 并且有7个共同的氨基酸突变位点。而JS2012被选取的毒株与Miller M6, iller M60株S蛋白氨基酸的比较, 仅发现2个相同的突变位点。我们推测, TGEVJS2012较高代次的毒株可能与Purdue P115一样, 有毒力降低的趋势。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1 细胞和病毒2
1.1.2 主要试剂与培养基2
1.2 方法 3
1.2.1 细胞培养3
1.2.2 病毒传代3
1.2.3 挑斑纯化3
1.2.3.1 制作6孔细胞板3
1.2.3.2 稀释和接种病毒3
1.2.3.3 观察病毒出斑情况以及挑斑3
1.2.4 病毒的RTPCR鉴定4
1.2.4.1 病毒总RNA的提取4
1.
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2.4.2 引物设计4
1.2.4.3 S1、S2、S3、S4和S5基因的克隆与测序4
1.2.5 S基因核苷酸与氨基酸序列分析4
2 结果5
2.1 病毒的RTPCR鉴定5
2.2 S基因核苷酸序列比较5
2.3 S基因核苷酸同源性比较6
2.4 S基因系统进化树6
2.5 不同次代病毒S蛋白氨基酸位点差异6
2.6 与有代表性的TGEV强弱毒株S蛋白氨基酸位点比较7
2.6.1 与Virulent Purdue, Purdue P115株S蛋白氨基酸位点的比较7
2.6.2 与Miller M6, Miller M60株S蛋白氨基酸位点的比较7
3 讨论 8
致谢9
参考文献9
不同代次猪传染性胃肠炎病毒S基因的鉴定及其序列分析
引言
猪传染性胃肠炎（Transmissible gastroenteritis, TGE）是一种由冠状病毒科猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus of swine, TGEV）引起的严重威胁世界养猪业的传染病。自1946年Doyle在美国确定本病病毒以来, 世界各国相继发出报道。该病毒性疾病具有高度接触传染性, 以严重腹泻、呕吐和脱水作为主要临床特征, 可以感染不同年龄和品种的猪, 其中2周龄以内的仔猪病死率可达100%[1]。TGE的发生和流行有明显季节性, 通常从11月到次年4月中旬。流行特点主要分为流行性、地方流行性和周期性地方流行性, 在寒冷季节常呈地方性流行, 且近年来又有进一步流行的趋势[2]。该病毒的基因组编码4种结构蛋白, 分别为糖基化的纤突蛋白S、膜蛋白M、小囊膜蛋白sM和磷酸化蛋白N[3]。其中S蛋白是TGEV基因工程疫苗和诊断技术等方面研究中最重要的一个靶蛋白, 应用较多。它可以诱导产生中和抗体并引起免疫保护, 另外, S蛋白对病毒的毒力、组织嗜性、受体结合位点、血凝性等生物活性功能起着重要作用[46]。因此, 对S基因进行遗传变异分析有助于我们研究TGEV的遗传演化规律和毒力改变的致病机理。编码S蛋白的S基因全长约为4300 bp, 位于病毒的最外层, 构成病毒的纤突。目前, 国外学者己对TGEV不同毒株的S基因进行的大量研究证明在S基因包含了4个主要抗原位点A、B、C、D。不同分离株的A、B和D位点比较保守, C位点则稍有变异[7]。本研究对适应细胞后的TGEV在ST细胞上传代200 代, 通过挑斑进行病毒的纯化, 并对S基因进行扩增、克隆, 序列分析及比较, 为弱毒株疫苗与基因工程疫苗的制备奠定一定的基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞和病毒
江苏省农业科学院兽医研究所实验室分离鉴定并保存的强毒株TGEJS2012。
江苏省农业科学院兽医研究所提供猪睾丸细胞（ST, ATCC）。
1.1.2 主要试剂与培养基
主要试剂
表1 主要试剂
Table 1 Primary Reagent
试剂名称
Name of reagent
生产商
Producer
DNA Marker DL 5000
TaKaRa 公司
pMD19T 载体克隆试剂盒
TaKaRa 公司
DH5α感受态细胞
TaKaRa 公司
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase
TaKaRa 公司
DMEM 培养基
GIBCO 公司
新生牛血清（FBS）
GIBCO 公司
胰蛋白酶
GIBCO 公司
反转录试剂盒
天为公司
HSTMMix
东盛公司
Trizol LS Reagent
Invitrogen公司
Agarose Gel DNA Purification Kit
Axygen 公司
主要溶液配方
表2 试剂与贮存液
Table 2 Reagents and stock solution
溶液名称
Name of reagent
方法
Method
10×TAE缓冲液
依次将 24.2 g Tris 碱, 5.71 ml 冰醋酸, 10 ml 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）加入 400 ml 超纯水中, 最后定容至 500 ml。
LB培养基（液体, 有抗生素）
依次将 NaCl 10 g, 胰蛋白胨 10g, 酵母提取物 5 g, , 氨苄青霉素5g, 溶于100 ml 去离子水中, 加入去离子水至总体积为 1000 ml, 高压灭菌。
LB培养基（固体, 有抗生素）
取琼脂糖3g, 加入200ml 含氨苄青霉素（50 μg/mL）的LB液体培养基中, 高压灭菌后, 在微波炉中煮沸, 摇匀后倒平板使用。

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