新型基因工具CRISPR/Cas9系统相比于ZFN和TALENs有特异性高、切割效率高、快速方便等特点，以广泛运用于分子生物学领域。本实验首先以小鼠的277827基因为目的基因，对比了三种不同转染方式的效率，即sgRNA和Cas9载体共同转染，sgRNA和Cas9合并载体的转染和慢病毒包装Cas9转染，结果发现sgRNA和Cas9载体共同转染的方式切割效率最高。之后尝试对猪链球菌2型05zy株CPSB基因进行敲除，构建载体时发现可能必须要用能在猪链2型中复制生存的质粒为载体，最后进行了体外切割并成功，证明sgRNA设计正确。
目录
第一章 研究背景 2
1.1 CRISPR/Cas9系统 2
1.1.1 CRISPR/Cas9系统研究历史 2
1.1.2 CRISPR/Cas9系统组成 2
1.1.3 CRISPR/Cas9系统作用机制 2
1.1.4 CRISPR/Cas9的应用 2
第二章 利用CRISPR/Cas9在猪链球菌2型中进行CPSB基因的敲除 4
2.1 前言 4
2.2 材料与方法 4
2.2.1 实验细菌、试剂及载体 4
2.2.3 载体构建 4
2.2.4 电转细菌 5
2.2.5 sgRNA体外转录 5
2.2.6 Cas9蛋白提取 6
2.2.7 体外切割实验 6
2.3 结果与讨论 7
第三章 利用CRISPR/Cas9在3T3和GC2细胞中进行小肽基因敲除 11
3.1 前言 11
3.2 材料与方法 11
3.2.1 材料 11
3.2.2 细胞培养及传代 11
3.2.3 sgRNA设计 11
单个sgRNA的设计插入参看第二章 12
3.2.4 载体连接 12
3.2.5 慢病毒包装 12
3.2.6 细胞转染 13
3.2.7 T7E1酶切 13
3.3.8 TA克隆测序 13
3.2 结果与讨论 14
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谢 17
参考文献 18
利用CRISPR/Cas9在真核和原核系统中进行基因敲除

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