摘 要沉默信息调节因子1（silent information regulator 1，SIRT1）是Sirtuin蛋白超家族之一，其在机体的炎症反应、糖脂代谢和肿瘤形成中发挥重要的调节作用。本研究根据大肠杆菌表达外源基因的特点，对鸡Sirt1基因的编码区的密码子进行优化，并在其5′和3′端分别引入Nde I和Xho I酶切位点序列，以这两个酶切位点将目的基因片段克隆入pCold III表达载体，获得重组质粒pCold III-gSirt1-hc。将重组表达质粒转入BL21（DE3）大肠杆菌，进行重组蛋白SIRT1的表达。分别通过调节诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG）的量、诱导时间等条件优化重组蛋白的表达工艺。经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）和Western blot检测结果表明，Sirt1基因经密码子优化后，重组表达菌在低温条件下和不同浓度的IPTG的作用下，均能产生一条分子量约在116 KDa的SIRT1重组蛋白。在15℃、0.1 mmol/L的IPTG诱导下，重组蛋白可在大肠杆菌中进行可溶性表达，与超声法破碎细胞提取的重组蛋白相比，采用珠磨法所得的重组蛋白粗提液经Ni2+亲和层析法纯化后，获得的重组蛋白纯度明显提高。以上工作为获得高纯度的重组蛋白SIRT1建立了表达和纯化工艺，进一步为深入解析SIRT1分子结构和为其抗体制备准备重组的抗原提供重要的物质保证。
目录
1 前言 1
2 材料与方法 2
2.1 实验试剂 2
2.2 实验仪器 2
2.3 常用试剂的配制 2
2.4 实验方法 2
2.4.1鸡Sirt1基因的优化和合成 2
2.4.2 鸡SIRT1重组表达载体pCold IIIgSirt1hc的构建 2
2.4.3 鸡SIRT1重组表达菌BL21pCold IIIgSirt1hc的构建 2
2.4.4鸡SIRT1重组蛋白的表达条件的优化 3
2.4.5鸡SIRT1重 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ^351916072* 
组蛋白的Western blot鉴定 4
2.4.6鸡SIRT1重组蛋白的提取 4
2.4.7鸡SIRT1重组蛋白的纯化 4
3 结果与分析 6
3.1鸡Sirt1基因表达序列的优化和合成 6
3.2鸡Sirt1基因重组表达载体的构建 7
3.3鸡SIRT1重组表达菌的构建 8
3.4鸡SIRT1重组蛋白诱导条件的优化 8
3.5鸡SIRT1重组蛋白的纯化 10
4 讨论 13
5 结果 15
参考文献 16
致谢 18
附录 19
1 前言
Sirtuin蛋白家族是一类依赖NAD+的、高度保守的去乙酰化酶[13]。沉默信息调节因子1（silent information regulator 1，SIRT1）是Sirtuin超蛋白家族的成员之一[4]，它主要位于细胞核内，可以使组蛋白和非组蛋白去乙酰化[3]，从蛋白质组参与蛋白的结构和功能的调节，从而改变细胞和机体的染色质结构、影响基因的表达调控和细胞代谢过程，生物学功能涉及细胞的生长周期、凋亡[5]、代谢状态和炎症及应激反应[1,2,4,6]。SIRT1的功能活性连接了细胞、机体的能量代谢和基因转录。肝脏是与脂质代谢有关的重要器官，当机体摄入过多的能量物质时，肝脏能将这些过量的能量物质转化为脂肪，并转运到脂肪组织贮存起来。长期摄入过多的能量最终会导致肥胖、脂肪肝和其他肥胖相关的代谢性疾病。目前SIRT1被认为是一个治疗肥胖及相关疾病的一个重要靶点[7]。
鸡肉是人们的主要食物之一，为了满足消费者的需求，现代商业肉鸡不断朝着生长快速，体重增加的方向发展[8]。但是现代商业鸡通常在腹部区域表现出过多的脂肪堆积，脂肪沉积过多会影响动物的健康、生殖繁育，产生瘦肉产出率、饲料利用率和产蛋率[9]下降等问题，与哺乳动物不同，禽类的肝脏是脂质合成的主要场所，SIRT1在家禽脂质代谢中起着更为重要的作用。因此，研究SIRT1对鸡肝脏的脂肪代谢的调控及其机制对于控制家禽的脂肪沉积极为重要。
为进一步研究SIRT1蛋白在家禽脂类代谢的作用，获得高纯度的鸡SIRT1蛋白就显得尤为的重要。因此，本研究利用基因工程技术，在大肠杆菌体系中表达鸡重组蛋白SIRT1，采用Ni2+离子亲和层析的方法得到大量高纯度的SIRT1蛋白，为深入解析其分子结构和为抗体制备准备重组的抗原提供重要的物质保证。
2 材料与方法
2.1 实验试剂
详见附录1
2.2 实验仪器
详见附录2
2.3 常用试剂的配制
详见附录3
2.4 实验方法
2.4.1鸡Sirt1基因的优化和合成
根据GenBank数据库提供的鸡Sirt1基因（AB160952.1）[10]的cDNA和蛋白序列，进行密码子分析，以鸡SIRT1蛋白的多肽氨基酸序列，利用同义密码子替换其中的稀有密码子合成Sirt1基因的编码序列，并对基因片段结构进行优化，得到核苷酸序列，并在5′和3′分别添加Nde I和Xho I酶切位点序列，由苏州泓迅生物科技股份有限公司进行合成。
2.4.2 鸡SIRT1重组表达载体pCold IIIgSirt1hc的构建
将优化、合成的鸡Sirt1片段（gSirt1hc）连接到本实验室改建的pCold III质粒中，同时在重组蛋白的3′端融合6个His。具体方法如下：分别用Nde I和Xho I酶消化质粒和目的片段 ，用T4DNA连接酶将gSirt1hc与pCold III质粒连接，获得重组质粒pCold IIIgSirt1hc。利用Nde I和Xho I酶对重组质粒pCold IIIgSirt1hc进行酶切鉴定，酶切结果经1%琼脂糖凝胶电泳检测（具体操作见附录），并测序鉴定pCold IIIgSirt1hc构建是否正确。
2.4.3 鸡Sirt1基因重组表达菌BL21pCold IIIgSirt1hc的构建
采用热刺激法将重组质粒转化入BL21大肠杆菌中（具体操作见附录），用50 μg/mL的Amp抗性筛选。挑取阳性菌落，37℃，225 rpm培养46h后，收集50 μL的菌液，100℃加热10 min，12,000 rpm离心3 min收集上清，以此裂解菌液为模板，用PCR法进行鉴定，引物(见表1)及反应体系如下：
表1 引物序列
引物
序列（5′ 3′）

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