CRISPR/Cas9系统是近年来广受关注的基因编辑系统，相比以前三代基因敲除技术，它具有高效，简单，通用等优点。到目前为止，已经在多个不同物种中成功应用，然而目前在灵芝中还没有建立成熟的CRISPR体系，本文报道了在灵芝中建立CRISPR/Cas9基因敲除体系，然后通过农杆菌转化法导入灵芝菌丝体中同时，为了提高转化效率，本文还尝试将本实验室前期构建的另一个Cas9载体通过脂质体转化的方法转入灵芝菌丝体中。
目录
摘要 1
关键词 1
引言 2
材料与方法 3
1.1 材料 3
1.1.1 供试菌株. 3
1.1.2 实验各类培养基： 3
1.1.3 主要试剂与溶液 3
1.1.4 主要仪器设备 3
1.2 Cas9质粒与GPIE质粒的提取 3
1.3 设计含有目的酶切位点的基因短序列 4
1.4 PMD19T载体的连接 4
1.4.1 连PMD19T载体体系的制备 4
1.4.2 电泳检测 4
1.4.3 切胶回收 5
1.4.4 酶连实验 5
1.4.5 感受态转化 5
1.4.6 测序 6
1.4.7 菌液质粒的提取 6
1.5 将Cas9质粒连上前面制备好的PMD19T载体 6
1.5.1 Cas9酶切 6
1.5.2 电泳检测 6
1.5.3 切胶回收 6
1.5.4 酶连实验 7
1.5.5 感受态转化 7
1.5.6 测序 7
1.5.7 所得菌液质粒的提取 7
1.6 将GPIE质粒连上上一步制备好的质粒上构成新的载体 7
1.6.1 GPIE质粒酶切 7
1.6.2 电泳检测 7
1.6.3 切胶回收 7
1.6.4 酶连实验 8
1.6.5 感受态转化 8
1.6.6 鉴定大肠杆菌的阳性克隆 8
1.6.7 菌液质粒的提取 8
1.7 pE *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: *351916072* 
ASYCas9质粒脂质体转化灵芝原生质体 8
2 结果与分析 9
2.1 Cas9质粒与GPIE质粒的提取 9
2.2 回收片段重新连接PMD19T载体，菌液PCR电泳 9
2.3 Cas9基因的连接 11
2.4 GPIE基因的连接 11
2.5 pEASYCas9质粒脂质体转化灵芝原生质体 13
3 讨论 13
3.1 转化方法 13
3.2 CRISPR/Cas9系统已在如下几种真菌中成功表达 14
3.3 不足之处 15
3.4 展望 15
致谢 15
参考文献： 15
灵芝中Cas9蛋白的密码子优化及基因敲除体系建立
学生 戴竹青
引言
引言
灵芝（Ganoderma lucidum）是著名的大型药用真菌，外形呈伞状，菌盖肾形、半圆形或近圆形，为多孔菌科真菌灵芝的子实体。2000多年前，我国就已视灵芝为药材。资料显示，灵芝内主要的有效成分是灵芝三萜类化合物，俗称灵芝酸（Ganoderic acid），具有调节免疫系统，保护肝脏，抵抗集体衰老及氧化等功能[1]。不仅如此，灵芝含有的多糖化合物、三萜类、核苷等各种对身体有利的化合物均具有强身健体，保护脏器，抗衰老抗氧化等优良特质。正是由于灵芝里面含有这么多种重要的药用成分以及各种对于细胞工场独特有价值的天然产物，所以灵芝已经成为当前生物研究领域的热点话题。目前常用的生物研究手段是基因敲除。预期通过基因敲除的手段，系统研究灵芝酸生物合成的调控网络，从而找到快速提高灵芝酸产量的方法，为商业化生产灵芝酸做好准备[13]。
基因敲除(knockout)是当前各领域生物科学研究中常用的一种DNA编辑技术[8]。由于基因敲除具有修饰后的染色体DNA可稳定复制的特性，所以目前被大量用于现代生物科研工作中。基因敲除的常见的手段是基因改造[4]。基本思路为先抑制特定基因不表达，然后通过建立对照组，继而研究该基因对表型的影响[5]，最后达到全方位了解给特定基因的生物学功能的目的[6]。为了实现基因敲除，需要在靶细胞中导入之前构建完成的打靶载体；导入载体后，载体DNA序列与靶细胞内同源DNA序列进行同源重组或与某些特定位点进行位置互换；载体DNA定向插入靶细胞基因上某特定位点，从而改变细胞遗传特性[7]。
CRISPR系统最初发现是在细菌中存在规律成簇间隔短回文重复序列，是细菌和古细菌的一种适应性免疫防御机制[89]。作为一个防御机制的系统，它具有能识别入侵的外源基因的功能，还能迅速做出反应，切割外援DNA。而这个特性也使得它成为一种有效的基因编辑手段，能被我们加以利用，用来进行敲除或者插入外来目的基因等操作。CRISPR/Cas系统主要分为I型、 II型和III型。与II型CRISPR/Cas系统（即CRISPR/Cas9系统）仅须Cas9蛋白不同的是，I型和III型系统需要多个Cas蛋白原件。目前该系统已经在斑马鱼、细菌、酿酒酵母[10]、拟南芥[11]等一系列物种中得到了应用。在所有的基因敲除体系中，CRISPR/Cas9系统是最简单方便，成本最低，而且也是效率最高的一种基因敲除体系。这也让该系统成为了目前世界上各实验室都在推广的体系。
农杆菌转化法的思路为选择一种特制的空质粒载体，该载体上应该含有TDNA边界序列，在序列之间含有复制原点、Hind III、BamH I、GUS报告基因、抗性基因等酶切位点（整个TDNA区域包含以上位点）[13]。一般流程为：先通过双酶切反应，酶切空质粒载体和目的基因，再通过酶连反应连接空质粒载体和目的基因，从而构建成完整的重组质粒[13]。构建完成重组质粒之后这个重组质粒的TDNA区包括TDNA边界序列、复制原点、GUS报告基因、突变启动子片段、抗性基因等。我们称这段TDNA区为目的片段。

原文链接：http://www.jxszl.com/swgc/swgc/67277.html