新型β内酰胺类耐药基因的筛选及异源表达【字数：9601】
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1 材料与设备2
1.1材料 2
1.2试剂与仪器 2
1.2.1化学试剂与酶2
1.2.2仪器与设备3
2 实验方法3
2.1耐药阳性克隆的筛选3
2.2 宏基因组文库抗性基因亚克隆的构建 4
2.2.1头孢他啶抗性基因亚克隆的构建4
2.2.1.1头孢他啶抗性基因单克隆质粒部分酶切4
2.2.1.2质粒酶切片段回收4
2.2.1.3 pET30a载体制备5
2.2.1.4 ERI100TMT1R感受态细胞的制备6
2.2.1.5 连接转化6
2.2.1.6 亚克隆双酶切验证7
2.2.1.7 测序7
2.3 β内酰胺酶的异源表达7
2.3.1 β内酰胺酶引物的设计7
2.3.2 目的基因的扩增与酶切8
2.3.3 表达载体的酶切8
2.3.4 感受态细胞E.coliBL21的制备8
2.3.5 连接反应9
2.3.6 β内酰胺酶的诱导表达9
2.3.7 β内酰胺酶的纯化10
2.3.8 β内酰胺酶的鉴定10
3 结果与分析11
3.1 ZF329和ZF937的PCR扩增结果11
3.2重组质粒pET28abla329和pET30abla937的双酶切验证12
3.3 序列对比结果12
3. *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ￥351916072￥
4 重组蛋白质的SDS PATG电泳检测13
4 讨论14
致谢14
参考文献15
新型β 内酰胺类耐药基因的筛选及异源表达
引言
青霉素的应用是20世纪医学的十大进步之一，但在青霉素应用的同时，人们也发现了青霉素酶的存在，即细菌对抗生素产生了耐药性。近年来，由于抗生素的大量使用和使用方式不合理等问题，出现了耐药菌株迅速产生并广泛扩散的现象。世界卫生组织已经把抗生素耐药基因作为21世纪威胁到人类健康的最重大挑战之一，并且要在全球范围内对抗生素耐药基因进行控制[1]。耐药菌产生β 内酰胺酶的临床意义很大，因为临床所见的耐药菌，约80%与β 内酰胺酶的产生有关，另外12%和8%的病原菌的耐药性分别与膜通透性的改变和靶位的改变有关[2]。文献报道，在所有种类的抗菌药物中，β 内酰胺类抗生素在美国的使用已超过65%[3]。
β 内酰胺酶是一种水解酶，可催化水解β 内酰胺类抗生素的特征性四元环β 内酰胺环，据文献报道的β 内酰胺酶有2000多种[4]，β 内酰胺酶种类繁多，Ambler等人根据酶分子结构的不同分为A、B、C、D四类[5]，不同的β 内酰胺酶，它的分子一级结构不同，但是其三级结构是相类似的。
细菌耐药的产生一般是染色体上结构基因发生突变，插入或缺失导致其所编码的结构蛋白改变，但基因突变引起的细菌耐药是不可传播的；或是获得外源耐药基因[6]，获得性耐药在临床上占有重要地位。β 内酰胺酶可由革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌产生，两者的耐药机制不同，革兰氏阳性菌的耐药机制是靶点改变，进而影响β 内酰胺类抗生素的活性，革兰氏阴性菌的耐药机制主要是通过质粒介导的获得性耐药，即质粒通过接合或者转导作用在不同的细菌之间转移。
由于在临床上和动植物养殖业中抗生素的应用比较多，因此之前对抗生素耐药基因的研究大多数集中在临床上分离得到的致病菌，但是，经过研究发现，在临床上以及动植物养殖业中发现的耐药基因均起源于土壤中的细菌[79]，土壤耐药基因组中包含许多尚未被发现的耐药基因，宏基因组学方法为挖掘土壤中的耐药基因提供了有效的途径。宏基因组学方法通过从样品中提取所有微生物的DNA，构建所有微生物的基因组文库，具有降低成本，不需要培养目标微生物，并且可以发现新型抗性基因的优点，对新型抗菌化合物的发现和新药的开发具有重要意义。
对于宏基因组文库库容量大，克隆数目多，筛选工作量巨大的特点，Healy 等人[10]构建了功能驱动的宏基因组文库进行筛选工作，即将提取的样本宏基因组DNA插入载体中，然后转化到宿主菌构建宏基因组文库，利用基因在宿主中表达所表现出的特征筛选出阳性克隆。
1 材料与设备
材料
珠穆朗玛峰土壤宏基因组文库
菌株：感受态细胞E.coliBL21、感受态细胞EPI100™T1R
载体：pET30、pET28a、pTG19T
1.2 试剂与仪器
1.2.1 化学试剂与酶
（1）氯化钠，购自上海生工生物有限公司
（2）琼脂糖，购自上海翊圣生物科技有限公司
（3）胰蛋白胨，购自上海生工生物有限公司
（4）氢氧化钠，购自西陇化工股份有限公司
（5）溴化乙锭，购自上海捷瑞生物有限公司
原文链接：http://www.jxszl.com/swgc/spzlyaq/563846.html
最新推荐
热门阅读
