抗生素在人医临床和动物疫病防治等方面的广泛应用，导致耐药菌和耐药基因在致病菌及自然环境中迅速传播，抗生素耐药性已成为了一个严重危险人类健康及生态环境的全球性问题。替加环素是临床上治疗革兰氏阴性菌多重感染的最后一道防线。然而近年来关于临床重要致病菌替加环素耐药性的报道越来越多，且耐药率有逐年上升的趋势。大部分耐药基因起源于土壤微生物，因此土壤中包含了大量未知的耐药基因。本研究拟应用功能宏基因组学技术从珠穆朗玛峰土壤宏基因组文库中挖掘土壤微生物来源的新型替加环素耐药基因，可为研究替加环素耐药基因的环境起源和传播机制提供一定的理论支持。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
一 材料与试剂3
实验材料与试剂3
土壤宏基因文库 3
1.2试剂与酶3
1.3溶液的配置3
实验仪器与设备4
二 实验方法5
1 耐药阳性克隆的筛选5
1.1 24孔板筛选 5
1.2 平板活性筛选5
1.3 阳性克隆质粒的提取6
2.耐药阳性亚克隆的构建6
2.1耐药阳性克隆质粒的部分酶切6
2.2 质粒DNA片段电泳7
2.3载体的制备8
2.4 感受态细胞的制备 9
2.5连接与转化10
2.6亚克隆质粒的酶切验证11
3.最小抑菌浓度MIC的测定12
3.1菌株培养12
3.2菌液稀释12
3.3 MIC测定13
三 实验结果与分析13
1.阳性克隆部分酶切13
2.载体的酶切和去磷酸化14
3.耐药阳性亚克隆质粒的验证14
4.测序 15
5.功能基因的确证及MIC测定 15
四 讨论16
致谢17
参考文献 18
土壤微生物中替加环素耐药基因的挖掘
引言
1940年,英国科学家弗莱明偶然间发现了青霉素 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ^351916072* 
，这是人类首次开始认识抗生素。此后数十年间有关抗生素的研究迅速发展。抗生素耐药性的产生，本质上来说是细菌的一种自然进化过程。抗生素在人医临床和动物养殖业中的的大量使用乃至滥用，大大加速了这一自然进化过程，导致细菌对抗生素的耐药性得以不断发展。目前，多重耐药菌在全世界范围内广泛传播，“超级细菌”也屡屡出现，抗生素耐药性问题已在世界范围内引起了极大关注[1.2]。
我国抗生素的生产量和消费量远远高于世界平均水平，并长期存在着不合理使用，缺乏严格的监管机制的情况。中国目前面临的抗生素耐药问题情势十分严峻。近年来，耐药细菌感染已经成为临床上感染性疾病患者死亡的主要原因。长此以往，人类恐再次面对无药可用的的窘境。采用何种方法有效监测耐药性的产生，如何避免出现新的耐药性同时能够控制现存耐药菌与耐药基因的传播，是目前有关耐药基因研究的重点。
抗生素是微生物自身的代谢产物，是在复杂环境中的为取得竞争优势得以生存而进化而来的。因此，环境微生物基因组中存在固有的抗生素抗性基因，表现为对抗生素的耐药性[3]。这些耐药基因基本上都起源于环境微生物，在长达数百万年间进化过程中，这些耐药基因进化出了出不同功能，使得微生物能够持续适应环境[4,5]。然而，抗生素的大量使用让耐药微生物与耐药基因传播扩散的速度大大加快，显著加速了抗生素抗药性的发展[6]。碳青霉烯类抗菌药物，属于临床各类疾病用于抗感染的一线药物[7]。然而，诸多研究表明，由于碳青霉稀类抗菌药物近年来的大量使用，再加上此类抗菌药物本身特性等原因，在临床治疗中已经出现了碳青霉烯类抗菌药的耐药菌株[8]。该类耐药杆菌的出现与流行，大大增加了临床抗感染治疗和医院内感染菌控制的难度[9]。而替加环素目前被认为是治疗该类耐药菌的最后一道防线。替加环素是第三代半合成四环素类抗生素。替加环素能与细菌16S rDNA结合，阻碍蛋白生成，控制细菌的活性。替加环素对于细菌核糖体有高亲和力，使得其绝大多数的需氧或厌氧的革兰氏阴性和革兰氏阳性菌有较强的活力。同时，相较于传统的四环素，替加环素能有效避免细胞外排泵和核糖体保护两类耐药机制，因此，替加环素在多重耐药革兰氏阴性菌感染疾病的治疗方面有难以取代的地位。然而近年来，在临床上重要的革兰氏阴性或阳性致病菌中也发现了替加环素耐药菌株，并有逐年递增的趋势。这一现象引起人们的警惕，关于细菌对加替环素的耐药性机理与传播机制的研究也成了热点。
研究发现，在临床上以及动物养殖业中发现的耐药基因均起源于土壤微生物[10]。土壤微生物蕴含了大量未知的耐药基因。耐药基因在环境中通过水平转移在微生物之间传播，环境中已经出现了大量的耐药基因。因此，对土壤微生物进行抗生素耐药基因的挖掘，通过对这些耐药基因的研究，有助于我们了解环境中的耐药菌基因的产生原理及耐药基因在细菌间传播途径。
本研究利用珠穆朗玛峰土壤宏基因组文库进行替加环素耐药克隆的筛选，并通过分子生物学和生物信息学方法从阳性克隆插入cosmid插入片段中挖掘出耐药功能基因，并对其体内和体外活性进行确认。
材料与试剂
实验材料与试剂
1.1土壤宏基因文库
土壤宏基因组文库：珠穆朗玛峰土壤宏基因组文库，珠峰文库是文库是一个含有约400 Gb 基因组信息的超大容量cosmid文库，文库总克隆数约为1.04×107，克隆平均插入片段为40 Kb。
1.2试剂与酶
试剂：胰蛋白胨（BactoTryptone） 生工生物工程（上海）股份有限公司
氢氧化钠（NaOH） 赛默飞世尔科技（中国）有限公司
琼脂粉（Agar Power） 北京索莱宝科技有限公司
丙三醇（Glycerine） 南京寿德试验实际有限公司
无水乙醇（Absolute Ethyl Alcohol） 南京寿德试验实际有限公司
溴化乙锭（EB） 上海捷瑞生物有限公司
苄青霉素（Ampicillin,AMP） 上海阿拉丁生物化工技术有限公司
氯霉素（Chloramphenicol,CHL） 上海阿拉丁生物化工技术有限公司

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