摘 要摘 要 滞育是由遗传控制的，呼吸代谢速率缓慢的一种动态过程。能使昆虫在不利的环境下存活，并使它的生活周期的活动阶段与可利用的食物来源相互协调。滞育在昆虫种的延续和种群繁衍中具有重要作用，家蚕又是典型的卵滞育型昆虫，所以深入了解家蚕滞育机理在蚕业生产以及农业害虫治理中非常必要。 本实验用秋丰越年活化3蛾蚕卵，采用蛾区半分法，分别用25℃明催青（滞育诱导）和17℃暗催青（非滞育诱导），孵化后25-26℃新鲜桑叶饲养。在实验前期对胚胎期滞育诱导和非滞育诱导条件的家蚕蛹期3d卵巢组织进行转录组测序获得183个上调表达基因和106个下调表达基因的基础上,本课题选择其2个差异表达基因，即羧酸酯酶B BGIBMGA000777、四跨膜蛋白BGIBMGA002919设计了特异性引物。解剖5龄家蚕3d、4d、5d及蛹期1d、3d、5d、7d获得脂肪体、卵巢、血液等组织样品，用Trizol法提取总RNA并反转录成cDNA以作为模板。用荧光定量PCR的方法探索这两个基因分别在滞育和非滞育诱导下在家蚕幼虫5龄期和蛹期不同发育时期不同组织的表达差异，为阐明家蚕滞育的分子机制积累实验数据。结果显示这2个基因在5龄期和蛹期不同诱导条件下不同组织间的表达均有差异，其中它们在蛹期3d卵巢组织中的表达与前期的RNA-seq结果一致，进一步验证这2个基因属于家蚕滞育相关基因。关键词家蚕； 滞育； qRT-PCR
目录
第一章 绪论 1
1.1 研究背景 1
1.2 家蚕研究历史 2
1.3 滞育过程 3
1.3.1 滞育前期 3
1.3.2 滞育期 4
1.3.3 滞育后期 4
1.4 滞育激素 5
1.5 影响滞育的因素 5
1.5.1 光周期 5
1.5.2 温度 5
1.5.3 食物 6
1.5.4 种群密度 6
1.6 滞育的发生和解除 6
1.6.1 滞育的发生 6
1.6.2 滞育的解除 7
1.7 国内外研究历史与现状 7
1.8 目前尚存在的问题 8
1.9 荧光定量PCR 8

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1.9.1基本概念 8
1.9．2.绝对定量 9
第二章 家蚕滞育关联基因BGIBMGA000777和BGIBMGA002919的表达特性分析 10
2.1 前言 10
2.2 材料与方法 10
2.2.1 供试材料 10
2.2.2 引物设计 12
2.2.3 总RNA的提取 12
2.2.4 琼脂糖凝胶电泳检测分析RNA质量 13
2.2.5 反转录 14
2.2.6 胶回收 14
2.2.7连接T载体 15
2.2.8 转化 15
2.2.9 质粒抽提步骤 17
2.2.11 制作甘油菌并测序 16
2.2.12 荧光定量PCR 18
2.3 实验结果 19
2.3.1 总RNA质量检验 19
2.3.2 引物特异性检测 19
2.3.3 标准曲线绘制 20
2.3.4 目的基因表达特性分析 21
结论 31
致谢 32
参考文献 34
第一章 绪论
1.1 研究背景
昆虫是现在世界上分布最广泛,种类最繁多、数量最巨大的动物。世界上的任何地方都有昆虫的存在。目前地球上的昆虫种类有100多万种,远超动物和植物的种类。昆虫之所以能成为如此繁荣的物种就在于昆虫对环境的适应能力强，能够在人类以及动物无法生存的环境中生存。而滞育是赋予它如此强大能力的最重要因素。滞育源自于昆虫对各种不利的环境的长期适应，当昆虫处于滞育状态时,其体内会发生一系列的生理化学变化。不同的昆虫种类拥有不完全相同的变化，但通常也有共同的特征，比如呼吸量减弱,体内各种激素及其所引起的代谢机制发生变化等等。人类研究昆虫的滞育调控机制，对于防治害虫、保护利用益虫、扩大农生产有很大帮助，从而影响实际中的科研与生产。一方面，对昆虫滞育的研究能够帮助我们对生物的发育模式调控有一个更深一步的理解；另一方面，通过深入进行昆虫滞育的研究,让我们对于昆虫的生长消亡的规律有更进一步的认识，帮助我们开发新的防治害虫和保护益虫的方法和理论，对于农业生产等许多领域都有着非常重要的实践意义和理论价值。由此看来，无论是害虫的综合治理还是益虫的合理利用，均离不开对滞育调控机制的系统研究[]。
家蚕作为一种典型的卵滞育型昆虫，在胚胎发育的早期就进入滞育。近一个世纪以来，为了全面深入地了解家蚕的滞育调控机制，有许多研究人员付出了相当大的努力进行研究，特别是许多新方法新技术的发明和投入使用，使得人们对家蚕的滞育机制有了一个非常深刻的认识，其中分子生物学的快速发展为科学家们提供了有力的工具。相对应的，滞育相关领域的研究也让滞育能够在实际生产发挥其独特有力的作用。滞育的最主要作用在于能够帮助家蚕度过不良环境和维持种群的发育齐一，而这是因为滞育赋予给了家蚕强大的抗逆能力。与非滞育卵相比滞育卵抗寒抗干燥力较强、体积较大、脂质储存量更大。这些改变增强了家蚕的生存能力，对蚕业生产有很大的意义。
家蚕作为具有中国特色的重要模式生物，具有很高的科研价值。同时家蚕还是经济类昆虫，由蚕丝制备的丝绸是很好的装饰品，自古以来就是我国的一种特有的商品，深受世界人民的喜爱。因此对于家蚕的研究，在科学和经济生活上都能有很大的收益。然而，虽然国内外学者关于滞育先后已经做出许多的研究，但关于滞育目前仍有许多未解开的谜题。为了更进一步地研究滞育的相关机理，本实验选取滞育相关差异表达基因，以“秋丰”五龄3d、4d、5d幼蚕以及1d、3d、5d、7d蛹为实验样本，解剖获得不同时期的脂肪体、卵巢、血液等组织。设计荧光定量PCR实验分析滞育关联基因BGIBMGA000777 和 BGIBMGA002919 分别在滞育和非滞育诱导下在不同时期，不同组织中的表达差异。试图为研究家蚕滞育的相关分子机理积累实验数据。
1.2 家蚕研究历史
家蚕是很早就由人类驯化并大规模养殖的动物。在我国古代，辛勤的劳动人民很早就懂得了栽桑养蚕、缧丝织绸。蚕丝文化是中华民族文化宝库中的一颗明珠，早已深深地印在了我国的文化血液中。蚕丝是我国古代的一张重要的名片，并且深受各国人民的喜爱。丝绸之路作为我国著名的与他国经济交流方式，有两大重要商品，一是瓷器，还有一件就是丝绸。在我国蚕业生产有着悠久的历史，据考证，不下于5000年。一直以来，蚕业生产在我国的产业经济发展史上占据着举足轻重的地位。目前，家蚕的身份不再仅仅是重要的经济昆虫，在科学研究方面，它也扮演着很重要的角色，许多科研领域都需要家蚕这一重要的模式生物。

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