目录
摘要 II
关键词 II
ABSTRACT III
KEY WORDS III
前言 1
1 材料与方法 2
1．1 材料和仪器 2
1．1．1 主要试剂 2
1．1．2 主要仪器 2
1．2 培养基及溶液配置 2
1．3 抗性菌株的筛选分离 2
1．4 抗性菌株的苞卫降解性测定 3
1．5 抗性菌株的16S rRNA基因序列分析及系统进化树构建 3
1．6 苞卫抗性基因 hppd 的克隆 4
1．7 载体的构建、异源表达及蛋白纯化 4
1．8 对苞卫、硝磺草酮和环磺酮三种HPPD 类抑制剂的抗性测定 5
2 结果与分析 6
2．1 苞卫抗性菌株的分离 6
2．2 抗性菌株16S rRNA基因序列及系统进化树分析 7
2．3 hppd基因序列的获得 8
2．4 HPPD 的异源表达 8
2．5 HPPD 的苞卫抗性分析 9
3 讨论 9
致谢 12
参考文献 13
苞卫抗性菌株的筛选及抗性基因的克隆表达
摘要
【目的】筛选对苞卫除草剂(Topramezone)[苯吡唑草酮]具有高抗性的菌株，并从中克隆其抗性基因4羟苯基丙酮酸双加氧酶(4Hydroxyphenylpyruvate dioxygenase，HPPD，EC 1.13.11.27)基因。【方法】将采集的土壤样品稀释涂布于以酪氨酸为唯一碳源的基础无机盐培养基上，其中加入不同浓度的苞卫作为选择压力，筛选分离出高抗苞卫的菌株。通过 16S rRNA 基因序列分析和系统进化树的构建确定抗性菌株的分类地位。将 PCR 扩增获得的Enhppd基因序列与pET29a (+)表达载体连接，转入大肠杆菌 Escherichia coli BL21(DE3)中进行异源表达，表达产物用Co2+亲和层析进行纯化并通过计算苞卫、硝磺草酮以及环磺酮三种HPPD抑制剂类除草剂对EnHPPD的IC5 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: @351916072@ 
0以分析其抗性情况。【结果】在含5 600 μmol/L苞卫的酪氨酸基础无机盐培养基上筛选分离得到1株高抗苞卫的细菌，命名为Ace21，初步鉴定该菌株为剑菌属。从菌株Ace21中成功克隆得到长度为1 113 bp的抗性基因，命名为Enhppd。Enhppd基因在大肠杆菌中实现异源表达，蛋白分子量大小约 40.0 kDa。抗性分析结果表明EnHPPD对苞卫的IC50高达12.7 μM，对硝磺草酮和环磺酮的IC50分别达到35.1 μM和23.6 μM。【结论】本研究克隆获得的 Enhppd基因具有极高的HPPD抑制剂类除草剂抗性，将为培育抗HPPD抑制剂类除草剂作物提供高抗性基因资源。

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