MicroRNAs（miRNAs）是真核生物体内重要的生物调节剂，通过抑制靶基因的表达发挥其功能，但对获取自miRNA靶基因预测系统的基因进行验证，实验结果显示该类系统的预测准确性仍有待提高。在此背景下，本课题以人类miR-1为代表，研究了影响miRNA抑制靶基因表达的因素及miRNA是如何抑制靶基因表达的。基于TargetScan、RNAhybrid、RNAfold等数据库的支持，获得并统计了与miR-1预测靶基因相关的众多参数。参照报告基因实验结果，对已验证靶基因中各参数与miRNA抑制靶基因强度进行了Pearson相关性比对，并对能否被miR-1抑制的基因在各参数之间进行了t-test差异性分析。研究结果表明，靶基因响应miRNA区段的GC含量和该区段组成热力学系统具有的能量在miRNA抑制靶基因表达的过程中发挥了重要作用。本研究为miRNAs如何以及是否抑制预测的靶基因做出了直观的评估，同时为人为选取系统预测的靶基因提供了参考。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
一．材料与方法3
1.1 材料与准备 3
1.2 生物信息学和统计学分析 3
1.2.1 数据获取3
1.2.2 数据整理3
1.2.3 统计学分析3
二．结果与分析4
2.1 靶基因MRE不同特征与miRNA抑制靶基因表达强度的相关性分析4
2.1.1 MRE长度和定位与miRNA抑制靶基因表达的强度无显著相关性 4
2.1.2 MRE中GC含量与miRNA抑制靶基因表达的强度具有相关性 4
2.1.3 MRE能量特征与miRNA抑制靶基因表达的强度具有相关性 5
2.2 miR1对基因的抑制作用在预测结合位点不同特征间的差异性分析 6
2.2.1 miR1的抑制作用在预测结合位点的长度和定位上无差异 6
2.2.2 miR1的抑制作用在预测结合区域的GC含量上无差异性 7
2.2.3 miR1的抑制作用在预测结合位点的能量特征上均无差异性 8
三．讨论9 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ^351916072* 

致谢10
参考文献11
影响人类microRNAs差异性抑制靶基因表达的因素
引言
引言
MiRNAs是一类长度约为22nt的内源短单链RNA，在生物体内由较长的RNA转录本茎环区加工而来，可以在不同的真核生物中对靶标mRNA进行转录后的抑制 1。自从遗传学家在秀丽隐杆线虫中发现了两种能够调控其发育及分化进程的miRNAs，lin4和let7以来2,3，经过二十余年不断的分子克隆和生物信息学研究，已经在不同的物种中鉴定出上百种miRNAs，同时证实miRNAs是生物体的发育和疾病的发生发展过程中一种重要的调节物和生物标志物4。
在真核生物的细胞核区内，miRNAs首先被转录为一段长约80nt的RNA茎环的一部分，随后又形成了一条长约几百个核苷酸长度的初级转录本（primiRNA）。接着，primiRNA首先被一种RNase III Drosha酶切割为前体miRNA（premiRNA），然后在转运蛋白Exportin5/RanGTP的作用下出细胞核进入细胞质，同时在另一种RNase III Dicer酶的进一步加工下，产生双链中间体，并与成熟的miRNAs和Argonaute2蛋白一同构成由RNA诱导的沉默复合体（RISC）5,6。在RISC复合体内，miRNAs可以被视作一种并不完整的mRNA序列引导物，通过碱基互补配对把功能性的核糖核蛋白（RNP）复合物招募到与miRNAs序列互补的靶标mRNA上，同时为之提供序列特异性的结合以允许RNP作用于特定的靶标，最终结果为剪切靶基因的转录产物或者抑制转录产物的翻译过程7。
在miRNAs与mRNAs相互作用的起始阶段，并非依靠miRNAs的整个序列对靶标进行识别。位于miRNAs序列5’端的长2~8nt的“种子区（seed sequence）”可以通过与其靶标mRNA的3’非翻译区（UTR）中的部分序列通过碱基互补配对完全或部分互补，从而选择性地抑制靶基因的表达，且该区域具有相当高的保守性8。因此，通过比对miRNAs与mRNA的序列在“种子区”的保守配对和补偿配对，评估miRNAs结合位点与miRNAs响应元件（MRE）的相对保守性，结合miRNAmRNA双链及上下游序列所构成热力学系统的能量特征等可以对miRNAs的靶基因进行较为准确的预测9。例如，由Bartel等开发的TargetScan算法在多个线性回归模型的基础上引入了包含了miRNAs结合位点附近AU组成、预测结构的可及性、开放阅读框（ORF）长度、miRNAs结合位点与终止密码子或聚腺苷酸化（polyA）位点的最小距离等14个因素的“ context ++”模型，现已成为一种日趋成熟的miRNAs靶标预测系统10。
经预测得到的miRNAs靶基因可通过多种策略对预测的可靠性进行验证，其中，双荧光素酶报告基因法是分子实验室中常用的校验手段之一。运用分子克隆技术，将包含有已经预测MRE的mRNA序列插入含荧光素酶基因和报告基因的表达载体的3’UTR，而后检查在miRNAs存在情况下荧光素酶的表达11。值得注意的是，大量实验证据表明，经算法预测得到的靶基因在双荧光素酶报告基因实验中得到的参数并不稳定，即并非miRNAs对所有经预测的靶基因都具有抑制作用，且在具有抑制作用的靶基因中miRNAs的作用效果也不具有一致性。因此，有必要对双荧光素酶报告基因实验结果和可能影响靶基因抑制程度的一些因素之间的关系进行分析，从而更好地判断预测基因的正确性，以便于在未来的实验中能够更准确地预测miRNAs的靶基因。
基于上述原因，设计了实验，探究miRNA抑制靶基因的表达过程中，是否存在单一因素造成的影响占主导地位，如果存在，哪些因素的影响更为显著？在miRNAs材料的选用上，我们选择了人类基因组中的microRNA1（miR1）。MiR1是一种肌肉特异性miRNA，优先表达于心肌和骨骼肌，在人体内有两种不同的miR1前体，即miR11和miR12，它们都被加工成相同的miR1成熟体，并在调节心脏的形态发生、维持心脏细胞的细胞周期正常的过程中发挥着至关重要的作用，另一方面，相比于其他类型miRNAs，有关miR1的研究相对充分，这有利于我们对研究结果进行更全面的比对与分析12,13。实验室前期的双荧光素酶报告基因实验为我们提供了miR1对96个经预测获得的靶基因的抑制参数：靶标报告基因的相对表达量R0（R0为存在miRNA条件下荧光素酶活性与阴性对照中荧光素酶活性的比值，与miRNA对靶基因的抑制强度呈负相关）14。通过比对R0在数值之间的差异，能够推知靶基因的表达是否受到抑制及受到抑制的程度。同时，获得了该96个靶基因的序列特征。在本课题的方案中，使用TargetScan、miRBase、miRanda、RNAhybrid和NCBI等数据库和系统，可以预测miR1的“种子区”和靶标mRNA上的MRE区域，进而对靶标mRNA中MRE区域的序列信息进行统计和分析，其中，MRE为靶标mRNA中一段可以部分或全部响应miRNAs的序列，miRNAs可以通过与在其mRNA靶标中的MRE区域发生碱基配对而发挥功能，并指导靶标mRNA内切核酸裂解或翻译抑制15。使用RNAfold数据库，可以获得与靶标mRNA的MRE序列热力学能相关的系数16。针对上述与序列特征和能量特征相关的参数，以前期实验获得的R0数值为参照分别进行相关性和差异性的比对，判断上述参数与抑制作用强度之间是否相关联，以及在miR1具有和不具有抑制作用的基因之间是否存在某些因素的差异，进而可以推知影响miRNA差异性抑制靶基因表达的因素。

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