多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（PGIP）是一种存在于植物细胞壁的抗病蛋白，能特异性结合病原体分泌的多聚半乳糖醛酸酶（PG），抑制PG对植物细胞壁的降解，其在植物的防御机制中起着重要作用。根结线虫是一种植物专性寄生病原线虫，根结线虫病是设施番茄重要根部病害，严重降低番茄经济效益。研究不同抗性生理特性品种的抗病基因差异，有助于选育抗病植物材料。本试验从10种不同抗性生理特性的番茄品种，经过根结线虫处理，筛选出3种高抗（‘NT-258’）、中抗（‘NT-259’）及高感根结线虫的番茄品种（‘NT-280’），克隆了其PGIP基因，进行碱基序列差异比对和分析，发现与高抗和中抗品种相比，高感品种‘NT-280’在保守区碱基存在2个SNP变异，有可能影响其蛋白质结构，导致抗性差异。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 3
1.1.1 植物材料3
1.1.2 试剂3
1.1.3 仪器3
1.1.4 装置材料3
1.2 方法 3
1.2.1 番茄穴盘育苗3
1.2.2 根结线虫的培养、分离及接种3
1.2.3 植株抗性筛选4
1.2.4 引物设计4
1.2.5 总RNA提取4
1.2.6 cDNA第1链的合成5
1.2.7 RTPCR扩增5
1.2.8 DNA序列分析5
2 结果与分析5
2.1 植株抗性筛选5
2.2 RTPCR扩增目的片段6
2.3 番茄PGIP基因的序列分析6
2.3.1 ‘NT258’PGIP基因序列分析6
2.3.2 ‘NT259’PGIP基因序列分析7
2.3.3 ‘NT280’PGIP基因序列分析8
2.3.4 ‘NT258’、‘NT259’和‘NT280’PGIP基因序列的比较9
3 讨论12
致谢13
参考文献13
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的克隆与序列分析
引言
引言
番茄（Solanum lycopersicum）是设施栽培重要的经济作物，也被公认为是研究蔬菜生理生化特性的模式作物，在我国各省各地普遍种植。其喜温而怕热，不同的生长发育阶段对温度要求也不同，在夏季高温多雨或冬季低温寡照栽培时，生长能力弱，对各种逆境抵抗力较差，极易发生病害，严重导致产量和品质的降低，选育出抗病虫害的番茄品种是急需解决的问题[1]。随着基因工程技术在蔬菜作物栽培上的应用和发展，抗病品种的选育工作越发成熟，研究抗病基因结构规律对病害防控有重要理论意义和实践价值。
植物富含多糖的细胞壁是抵抗病原真菌侵染的第一道屏障。多聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase，PG）是病原体感染植株最先分泌的最重要的一种细胞壁降解酶，它能够分解细胞壁的构成成分——果胶。PG通过降解植物细胞壁使其它细胞壁降解酶对其底物的攻击更容易，同时为病原体的生长发育提供大量的糖源[2]。植物在与病原体的斗争过程中，自身形成了一套有效的防御体系。多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（Polygalacturonaseinhibiting protein，PGIP）是与植物自身抗病性相关的多功能蛋白，属于植物胞外的富含亮氨酸重复序列（extracellular leucinerich repeat，eLRR）结构的细胞壁结合蛋白，能特异性地结合病原体分泌的PG，降低PG的水解活性，从而抑制病害的发生。同时促进高浓度寡聚半乳糖醛酸（Oligogalacturonides，OG）在植物体内累积，激活并表达包括PGIP基因在内的一系列防卫相关基因来增强植物抗病性，从而更有效地抵御病菌侵染[25]。PGIP在植物防卫反应等方面引起了广大学者的关注，围绕PGIP所开展的研究也十分广泛[610]。PGIP还与果实的发育过程、胁迫反应、冷藏、浆果果实的病虫害等有关[11]。因此，PGIP基因受到国内外研究者的高度重视并成为目前抗病基因工程研究的重点。国内外已从树莓[12]、苹果[13]、梨[14]、柑橘[15]、樱桃[16]、大豆[17]等植物中克隆了PGIP基因，但番茄中研究较少。
根结线虫（Meloidogyne）是一种高度转化型的植物专性寄生病原线虫，也是危害农作物最普遍最严重的线虫之一[18]。根结线虫主要为害各种蔬菜作物的根部，形成近球形膨大的白色根瘤，被害株地上部生长受抑制，甚至提早枯死。由于设施条件局限、化肥施用过量、土壤水分平衡破坏等原因，土壤盐渍化和土传病害等连作障碍日益严重，导致番茄根结线虫病等病害发病率不断上升[19]。根结线虫病是设施番茄重要病害之一，对番茄植株的生长、产量、品质危害严重。在抗病品种中，植物可对根结线虫的侵染产生防卫反应，调控抗性基因表达，抵抗线虫的寄生行为。在感病品种中，根结线虫分泌物质刺激植物根部形成特殊的取食结构巨型细胞，以供自身生长和繁殖[20]。线虫主要依靠分泌蛋白质来完成寄生过程，比如通过分泌破坏细胞壁结构的酶类，包括果胶水解酶，它可以降解果胶质，破坏植物相邻细胞中间层黏结物，多种蛋白质的分泌使得线虫能够入侵植物组织进行寄生生活，也使得其他土传性病害的侵染更为容易[21]。生产上对于根结线虫等病虫害的防治以化学防治为主，但化学防治农药残留高，不能从根本上解决根结线虫的危害，选育抗病品种是防治病害最直接、环保和有效的途径[22]。传统的有性杂交方法育种周期长、效率低，而近年来生物技术不断发展，利用基因工程进行品种改良成为新的发展方向，目前已有多个抗病基因被克隆，选育具有抗病基因的植物材料，可以很大程度地缓解病虫害的负面影响。
在番茄中，对于抗根结线虫基因的研究已有大量报道，特别是抗病Mi基因的成功克隆，标志着根结线虫抗性机理研究已达到一定水平，将Mi1基因转育到栽培番茄材料时，发现它能有效抑制线虫寄生[2324]。病原体侵染植物时分泌的第一个细胞壁降解酶是PG，它能催化富含多聚半乳糖醛酸的细胞壁果胶的降解，而PGIP能与PG特异结合降低PG活性，减缓细胞壁降解，增强植物抗病性，在植物防御机制中起着重要作用。抗根结线虫为垂直抗性，PGIP基因对病虫害的抗性一般为水平抗性，不易被病菌克服，研究PGIP基因更有广泛的指导意义，并且关于番茄PGIP基因的研究少见报道。通过接种根结线虫，筛选抗病和感病品种，研究不同抗性品种PGIP基因序列差异，进一步推断PGIP与病原菌PG相互识别的差异性，有助于应用PGIP基因改良农作物抗逆性，为设施蔬菜可持续生产和番茄抗病品种的选育提供依据。

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