金针菇是世界上著名的食用菌和药用菌，包含了许多具有营养价值的成分，如八种人体必需氨基酸、植物性膳食纤维及一些活性物质，能起到保健作用。然而目前金针菇生产链已相对完善，生产量在近十年飞速增长，到如今已趋于饱和。目前金针菇的生产重心开始向高品质转移。因金针菇中氨基酸含量丰富，尤其是精氨酸和赖氨酸的含量高于其他的食用菌品种。在金针菇的生产中，如何通过调控进一步调高精氨酸和赖氨酸的含量已经成为提高金针菇品质的重要途径。硝酸还原酶（NR）是生物体中普遍存在的一种酶。它能同化NO3- ，使其还原成NO2-。帮助不能以NO3-为直接氮源的吸收利用其中的氮。本实验主要探讨NR能否通过氮代谢调节金针菇内精氨酸、赖氨酸的含量，从而提升金针菇品质。克隆金针菇中NR基因片段，并构建硝酸还原酶沉默载体。随后，通过脂质体转化将沉默载体转到金针菇菌丝中，测定野生型金针菇菌丝和沉默转化子内的赖氨酸、精氨酸含量。测定结果发现前者和后者的氨基酸含量并没有显著性差异，证明NR并不能直接调节金针菇内的赖氨酸、精氨酸含量。
目录
摘要 4
关键词 4
Abstract 4
Key words 5
1前言 5
2材料与方法 6
2.1材料 6
2.1.1实验菌株 6
2.1.2培养基的配制 6
2.1.3仪器与试剂 6
2.2试验方法 7
2.2.1 RNA的提取和反转录（cDNA文库的制备） 7
2.2.2设计引物 7
2.2.3 PCR扩增目的片段 7
2.2.4 电泳鉴定且割胶回收 8
2.2.5 连接T载体 8
2.2.6化学法制备大肠杆菌感受态细胞及转化 8
2.2.7 克隆转化子的验证及测序 9
2.2.8 碱裂解法提取质粒 10
2.2.9酶切与回收 10
2.2.10沉默基因与沉默载体酶连 11
2.2.11转化与测序 11
2.2.12分装保存菌液与质粒 11
2.2.13 原生质体制备 11
2.2.14 脂质体转化 12
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2.2.15荧光定量PCR验证沉默转化子的沉默效率 12
2.2.16 种子培养 13
2.2.17 液体种子的制备 13
2.2.18 二次摇瓶发酵 13
2.2.19精氨酸含量测定 13
2.2.20赖氨酸含量测定 13
3 结果与讨论 14
3.1金针菇中硝酸还原酶的生物信息学分析 14
3.2构建NR沉默菌株实验凝胶图 14
3.2.1 NR片段扩增凝胶图 15
3.2.2 在NR片段上连接T载体凝胶图 15
3.2.3酶切凝胶图 15
3.2.4 酶切产物酶连凝胶图 16
3.2.5 NR沉默片段电泳图 16
3.3 NR转录水平变化 17
3.4 NR对精氨酸含量的影响 18
3.5 NR对赖氨酸含量的影响 19
3.6 讨论 20
致谢 21
参考文献 21
金针菇NR基因的克隆沉默菌株构建及功能研究
引言
1前言
金针菇[Flammulina velutipes(Curt.:Fr.)Sing.]，又可以称为冬菇、构菌、朴菇、毛柄金钱菌，属于担子菌亚门(Basidiomyco tina)，层菌纲(Hymenomy cetes)，伞菌目(Agaricales)，口蘑科(Tricholomataceae), 金钱菌属(Flammulina) [1]。其菌盖呈圆形十分圆滑且极小，菌形如其名字一样呈铜钱状，色泽黄间白，菌柄细长娇嫩，是著名味美鲜嫩的食用菌和药用菌[2]。
金针菇之所以这么著名取决于其包含的营养物质。除了基本元素碳、氮、磷、硫、钾、锌、钙等以外，金针菇内的主要水分达到90%以上，含水量极高。糖、脂肪、蛋白质和氨基酸等能量物质占比达到8%左右[3]。其中氨基酸包括18种人体必需氨基酸和非必须氨基酸，必需氨基酸含量为6.96%，占总量的40.28%，赖氨酸含量占总氨基酸的6.3%。在金针菇中，赖氨酸和精氨酸的含量特别高。现代医学证明，赖氨酸能够促进儿童生长发育，精氨酸参与改善免疫系统[4]。其次两者作为氨基酸能够调节维持生长、繁殖和免疫所必需的关键代谢途径。补充其中一种或一种氨基酸可能有益于改善生命周期不同阶段的健康问题(如肥胖、糖尿病、心血管疾病和代谢综合症)；优化代谢转化的效率，以提高肌肉生长、产奶量、蛋和肉的质量，同时防止过度运动。因此，氨基酸在营养和健康方面具有重要的作用[5]。同时，金针菇中还存在多种活性物质。如多糖，能够参与肿瘤、抗菌、抗病毒等免疫调节，起调剂作用[6]。膳食纤维，金针菇内碳源的主要提供者，占到整个金针菇干重的22.4%31.2%。经研究发现其对小鼠有降低血糖，血压和胆固醇的作用[7]。因此金针菇经常作为人们研究营养价值的对象，通过一些分子手段，提升金针菇的品质。
硝酸还原酶（nitrate reductase，NR）是一种含有Mo的酶，属于DMSO还原酶家族，在氮循环的代谢中起关键作用，将硝酸盐还原成亚硝酸盐，是硝酸盐还原途径中的限速酶，通过NADH和 NADPH转移两个电子来起到催化作用。由于细胞的位置、结构和功能不同，它们被分为周质（Nap）、细胞质和膜结合硝酸还原酶[8]。硝酸还原酶的构造繁琐，由多个亚基组成。经研究发现，高等植物中的NR由两个分子质量在100kDa到110kDa的亚基共同组成同源二聚体。每一个亚基都等同于一个氧化还原中心，它们能够催化转移电子。两个亚基组合在一起形成了三个功能域。这三个功能域能够通过两条铰链连接在一起，形成一个联合区域，从而被其他二聚体识别发生反应。当存在二价阳离子的时候，其中一条铰链发生扭曲，使硝酸还原酶的结构发生改变，使其成为一个完全没有活性的复合二聚体，从而抑制了酶的活性。在真核生物中已发现了三种硝酸还原酶，存在于真菌中的主要为NADPHspecific(EC1．6．6．3)[6]。

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