随着工矿业的发展，土壤重金属污染情况日益严重，这些土壤上生产的粮食作物通常具有重金属超标的风险，培育低重金属积累的作物新品种是应对措施之一。本实验室前期研究结果表明，铜处理下OsGLP8-7的表达量显著提高，OsGLP8-7启动子的组织化学染色进一步验证了该结果。通过酵母单杂交实验筛选得到OsGLP8-7可能的转录因子OsWRKY72，并通过荧光素酶报告基因实验进行验证，结果表明OsWRKY72对OsGLP8-7具有负调控作用。然而qPCR结果表明铜处理下OsWRKY72的表达量也会提高。
目录
摘要 3
关键词 3
Abstract 3
Key words 3
引言 3
1 材料与方法 5
1.1 实验材料 5
1.2实验方法 5
1.2.2 分析水稻OsGLP87的转录调控情况 5
1.2.3 筛选OsGLP87的转录因子 6
1.2.4 检测重金属处理下OsWRKY72的表达水平 6
2 结果与讨论 6
2.1水稻OsGLP87基因表达调控的分析 6
2.1.1 OsGLP87启动子顺式作用元件分析 6
2.1.2 水稻OsGLP87基因的诱导表达 7
2.1.3 重金属Cu及其梯度浓度处理下OsGLP87pro表达量 7
2.2 筛选OsGLP87的转录因子 8
2.2.1 酵母诱饵菌株的制备 8
2.2.2 酵母单杂交筛库 9
2.2.3 荧光素酶报告基因实验 9
2.3 重金属胁迫下OsWRKY72的表达量 10
3 讨论 10
致谢 11
参考文献 11
水稻类萌发素基因OsGLP响应重金属胁迫的转录调控初探
引言
引言
根据环境保护部和国土资源部发布的全国土壤污染状况，结果显示，全国土壤环境状况总的来说不尽人意，部分地区土壤污染较重，耕地土壤质量堪忧，工矿业废地土壤环境问题突出。因此种植的粮食作物重金属含量超标的风险极大，粮食安全也成为人们日益关注的问题。 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: @351916072@ 
有研究指出，重金属污染类型主要以Cu、Cd、Pb、As等重金属为主[1]。
多数植物由于长期处于重金属胁迫的环境中，渐渐地形成了耐性机制和避性机制。避性机制包括植物利用根系分泌物影响微生物的活性和重金属的移动性以降低进入植物体内的重金属含量[2]，还有细胞膜、细胞壁、液泡的隔离和区化作用[3]。而耐性机制是指植物本身具有减轻体内重金属毒害的生理机制，具体为渗透调节、螯合作用和抗氧化系统等[4]。一旦植物受到重金属的胁迫，体内活性氧包括过氧化氢 (H2O2) 、超氧阴离子(O2.)和羟自由基(.OH)大幅度增加，这时较高浓度的活性氧 (ROS)产生膜脂过氧化作用，会阻碍植物生长甚至导致其死亡。而植物通过增强酶促和非酶促系统中相关抗氧化剂和抗氧化酶活性，将活性氧自由基消除掉，就可以维持正常代谢水平[5]。由此可以看出，植物为了减轻重金属对自身的胁迫所产生的避性机制和耐性机制，在其生长发育和代谢过程中起到了关键性的作用。
在Pb、Cd、Cu、Ag、Hg等众多的重金属元素中，Cu是植物生长发育所必需的微量营养元素，Cu的含量对其生长状况也有着一定的影响。适量的Cu可以使植物生长的更加茁壮，但是Cu若是过量则会阻碍植物正常生长，不利于植物根叶的发育。Cu可以作为辅基，在植物的呼吸代谢中发挥作用，以此影响植物体内的酶活。例如苯丙氨酸解氨酶（L－phenylalanine ammonialyase，PAL）、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）、多酚氧化酶（Polyphenol Oxidase，PPO）、过氧化物酶（Peroxidase，POD）等，都会因为Cu过量导致自身被抑制，使其酶活性下降，甚至完全丧失。实验证据表明，由于Cu的诱导，使叶片质外体和植物根系中积累H2O2，并且质膜上NADPH氧化酶的活性上升，推测是由于NADPH氧化酶的作用导致了质外体H2O2的积累[6]。在种类众多的ROS分子中，H2O2作为重要的逆境信号分子之一，参与了根生长和不定根形成、细胞衰老和程序性死亡、气孔运动等过程。在受到胁迫的条件下，H2O2的快速积累能够诱导一系列的信号转导过程和逆境防御反应[7]。
有研究提出，在Cu胁迫下，植物组织中的木质素含量会明显提高[8]。培养液中Cu浓度的增加会使人参根的悬浮细胞木质素合成相关酶, 如PAL、肉桂醇脱氢酶（CinnamylAlcohol Dehydrogenase，CAD）和咖啡酸POD的活性升高，同时会积累酚类化合物和木质素[9]。另有研究指出，Cu胁迫的初始阶段, 大豆根部漆酶（Laccase，LAC）负责催化细胞外的木质素单体聚合反应，后期阶段POD活性逐渐上升, 与LAC一起调控植物体内木质素的生物合成[10]。这说明Cu可能通过增强POD和LAC催化的木质素聚合作用来调控木质素单体的合成，促使木质素的积累。另外，H2O2也在一定程度上影响植物细胞木质素的合成，例如使用H2O2清除剂（KI）清除H2O2的话能够导致冷杉悬浮细胞胞外木质素的含量急剧降低[11]。
植物响应重金属胁迫的生理机制涉及到复杂的基因表达调控网络，通常是多基因参与的协同防御反应，共同抵抗逆境。当植物感受到胁迫刺激，就会激活细胞质中的信号转导途径，如Ca2+和蛋白信号等，启动表达胁迫应答基因，使植物再一次达到新的代谢平衡，以应对来自外界的胁迫刺激。该过程主要涉及诱导基因（环境因子和发育因子），表达调控元件（顺式作用元件和反式作用元件），响应应答的生化通路和多种信号传导分子[12]。在转录水平上，会激活一些参与非生物胁迫防御反应的基因，并且将其克隆，通过编码主要的代谢蛋白和调控下游基因的表达来增强耐逆性[13]。其中有一类基因被称为调控基因，可直接参与非生物胁迫反应，负责下游基因的表达调控和信号转导，包括在信号转导通路中参与信号转导途径的转录因子[14]。
植物响应各种非生物胁迫有多种转录因子参与其中，如WRKY家族、MYB家族、bZIP 家族、NAC家族、锌指蛋白等[15]。鹰嘴豆CarNAC4、CarNAC5和CarNAC6基因可以提高转基因拟南芥植株的耐旱性[16]。盐胁迫、ABA和PEG 6000能够诱导bZIP转录因子基因GmFDL19 的表达，该基因过表达可以提高大豆对盐胁迫和干旱的耐性[17]。重金属能有效诱导多种转录因子基因的表达,表明转录因子在提高植物对重金属的抗性中发挥着重要作用[18]。在Cd处理后，WRKY53的表达水平发生明显变化[19]，MYB4也会出现高表达[20]。在酸性土壤中，通过锌指转录因子（包括拟南芥的STOP1、WRKY46和水稻的ART1）的转录调控能够增强植物耐铝能力[21]。在植物中，有一种很关键的减轻重金属胁迫的方法是调节重金属的应答基因表达[22]。有研究指出，WRKY46对水分胁迫(渗透、干旱和盐胁迫)的响应极为明显；在铝处理条件下，3小时后WRKY46的表达出现了显著下调，同时ALMT1（苹果酸转运蛋白）的表达也受铝处理的诱导，而且WRKY46和ALMT1在拟南芥的根中存在着共同的表达区域，即两者都在根的中柱表达，这说明WRKY46和ALMT1可能存在调控关系。表型分析发现，相较于野生型，WRKY46突变体在铝处理下表现出更高的耐铝能力[23]。王艺桥等[24]对AtWRKY31进行了亚细胞定位和转录活性分析，并利用qRTPCR检测AtWRKY31在不同逆境处理条件下1、3和12h后的表达变化，通过酵母双杂交（Y2H）实验以及双分子荧光互补（BiFC）实验筛选并验证了其互作蛋白，结果发现AtWRKY31定位于细胞核，具有转录抑制作用，并且低氮、低钾、热害等处理显著抑制其表达。

原文链接：http://www.jxszl.com/swgc/smkx/563643.html