从半乳糖到葡萄糖-1-磷酸的转化过程是一系列酶促反应过程，也称为Leloir途径，半乳糖激酶（Glacokinase，简称Gal K）是该途径中的四种关键酶之一。在该实验中，首先诱导携带Gal K基因的大肠杆菌BL21(DE3)菌株表达野生型Gal K蛋白，同时将Gal K基因的176I/R突变株转入感受态大肠杆菌BL21中，经扩大培养后诱导基因表达，分别提取细胞的内容物并使用Ni2+树脂亲和层析柱对两种蛋白进行了纯化。由于突变基因的突变位点位于蛋白反应中心，因此引入的突变导致了蛋白质活性的相应改变，在实验中通过测定提取到的两种蛋白的催化活性评估了突变对蛋白功能的影响。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
绪论3
1材料与方法5
1.1 Gal K菌株验证5
1.1.1菌种5
1.1.2所用仪器设备及试剂5
1.1.3 实验方法.5
1．2 176I/R基因原核表达载体的构建.........6
1.2.1菌种及质粒6
1.2.2所用仪器设备及试剂6
1.2.3实验方法6
1．3 IPTG对Gal K、Gal K 176I/R基因的诱导表达8
1.3.1 菌种8
1.3.2 所用仪器设备及试剂8
1.3.3 实验方法 8
1.4目的蛋白的分离与纯化9
1.4.1 实验材料9
1.4.2 所用设备仪器及试剂9
1.4.3 实验方法 9
1．5 Gal K及Gal K 176I/R突变蛋白的SDSPAGE电泳检测..9
1.5.1 待测样品9
1.5.2 所用仪器设备及试剂9
1.5.3 实验方法9
1．6 野生型Gal K与Gal K 176I/R突变蛋白的酶活检测.....10
1．6．1 实验材料..10
1．6．2 所用仪器设备及试剂......10
1．6．3 实验方法..10
2结果与分析10 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ^351916072^ 

2．1 Gal K菌株质粒的琼脂糖电泳图......10
2．2 Gal K 176I/R基因原核表达载体的质粒电泳图.....11
2．3野生型Gal K与Gal K 176I/R突变蛋白SDSPAGE电泳..12
2．4 标准半乳糖溶液浓度曲线.......12
2．5酶反应的吸光度变化曲线........13
2．6 标准BSA浓度曲线..14
2．7野生型Gal K、Gal K 176I/R的酶活性比较.....14
2．8结论....15
3讨论..15
致谢15
参考文献15
半乳糖激酶基因在大肠杆菌中的表达、纯化研究
引言
糖缀合物广泛存在于生物体中并在生命过程中起着非常重要的作用。对糖链进行修饰将会影响糖缀合物的功能，目前在许多研究领域已经开始了糖链修饰工作[1]。例如在新药研制方面，通过对含糖苷抗生素的糖链进行修饰，可以得到新的抗生素；在材料学领域，将不同的糖基引入材料的主体或表面，可使材料的功能发生变化；再例如，将天然多糖分子如肝素固定在分离膜表面可提高其细胞相容性和血液相容性。
近年来，糖生物学方向的研究正在不断发展进展，合成技术不断的进步, 利用非天然糖对糖缀合物糖基进行修饰成为一种新的研究趋势[2]。
由糖基转移酶完成的，将糖基供体的单糖部分转移至受体的糖基化过程被称为Leloir途径（如图1）。半乳糖激酶（galactokinase ,Gal K）在αD型半乳糖磷酸化转变为1磷酸半乳糖的过程中发挥着重要作用，它在有ATP的情况下可以使αD半乳糖转化为半乳糖1磷酸。在人体中，编码半乳糖激酶的基因的突变可引起II型半乳糖血症。半乳糖血症是一种很罕见的隐性致死遗传病，可导致患者智力发育迟缓、肝功能障碍、白内障[3][4]等。


图1 Leloir途径示意图
Galctokinase (GalK):半乳糖激酶；galactose1phosphate uridylyltransferase (GalT):半乳糖1 磷酸尿苷酰转移酶；
UDPglucose 4epimerase (GalE): UDP葡萄糖4差向异构酶
最近几年来对Gal K的氨基酸序列的分析表明，Gal K属于一个独特的ATP依赖性GHMP超家族，同一超家族的其他蛋白有高丝氨酸蛋白激酶（homoserine kinase）、甲羟戊酸激酶（mevalonate kinase）、和磷酸甲羟戊酸激酶（phosphomevalonate kinase）等。它们在结构上都具有一定的相似性[5]。James B. Thoden与Hazel M. Holden已经获得了分辨率为2.1Å的Gal K蛋白晶体结构，并对其酶反应中心氨基酸残基的功能进行了研究。从研究的结论来看，与半乳糖结合相关的关键氨基酸残基有Arg36, Glu42，Asp45, Asp183,以及Tyr233，Arg36、Asp183都是在半乳糖激酶序列数据库中的严格保守位点。通过对半乳糖、磷酸基团结合位点的观测，认为Asp183是催化反应的基础位点，在这里发生半乳糖1位羟基的磷酸化反应，而Arg36在反应机制中起的作用是降低1位羟基的pKa值[6]。
合成非天然糖有两种主要的方法，即化学法合成以及生物酶法合成[7]。化学法合成的关键在于糖苷键的形成[8]。由于糖分子中存在多个性质相似的羟基，因此可以参与糖苷键的形成，且既可以产生α构型的糖苷键也可能产生β构型的糖苷键。因此，为了准确地合成某种连接方式的寡糖，就需要对某一些基团进行选择性的保护与脱保护，这也导致了合成的过程非常复杂。因此，通过酶法合成非天然糖成为了研究热点。酶法合成的特点是快速、高效、反应条件温和且具有立体专一性[10]。但是酶法合成中需要糖核苷酸作为单糖的供体，糖核苷酸的昂贵限制了生物酶法的应用。因此建立简单易得的糖核苷酸文库成为了解决问题的关键。

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