甲基化CpG结构域（Methyl-CpG-Binding Domain, MBD）蛋白家族是一类在真核生物中进化保守的核蛋白家族。MBD蛋白能够直接结合甲基化序列，招募其它蛋白共同调节生物体DNA甲基化水平，对动植物生长发育过程起着重要作用。本研究利用一种来自古细菌及真细菌中天然存在的抵抗外源DNA侵入的获得性免疫系统改造而成的CRISPR/Cas9（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated9）基因编辑技术，通过2xCaMV35S启动子调控CAS9基因表达，以AtU6-26启动sgRNA的基因编辑载体系统，实现对拟南芥MBD5和MBD6基因的编辑。经PCR特异性扩增和测序验证以及突变位点鉴定，证明了CRISPR/Cas9技术能够精确高效地对靶序列编辑，并成功获得了拟南芥MBD5及MBD6基因突变体，为进一步研究MBD蛋白结构域在拟南芥DNA甲基化中的功能提供了实验材料。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
1引言 1
1.1 CRISPR/Cas9技术概述1
1.1.1基因编辑技术1
1.2.2 CRISPR/Cas9系统3
1.2.3 CRISPR/Cas9在植物基因组编辑中的应用4
1.2 植物甲基化4
1.3 植物MBD蛋白家族5
2 材料与方法6
2.1 实验材料与试剂6
2.1.1材料6
2.1.2仪器与试剂6
2.2 方法6
2.2.1溶液配制6
2.2.2 野生型拟南芥种子消毒播种6
2.2.3 PCR扩增7
2.2.4 sgRNA设计及Oligo序列合成7
2.2.5 CRISPR/Cas9重组载体的构建7
2.2.6农杆菌转化及侵染拟南芥8
2.2.7拟南芥阳性植株鉴定8
2.2.8突变位点鉴定9
3结果与分析 9
3.1 AtU6 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: @351916072@ 
26sgRNA重组中间载体的构建9
3.2 pCAMBIA1300AtU6CAS9重组质粒构建9
3.3 拟南芥MBD5/6基因突变植株的获得及验证10
4讨论 12
致谢13
参考文献13
利用CRISPR/Cas9技术构建拟南芥MBD5/6基因突变体
引言
CRISPR/Cas9技术概述
基因编辑技术
自上世纪七十年代吴瑞、Sanger、Gilbert等人建立DNA测序技术以来13，全基因组测序技术和基因组学迅猛发展，随着越来越多生物物种全基因组序列信息的获得，如何解析海量的基因组信息中特定基因功能成为了新的挑战，高效精准的基因编辑技术能够为这一问题提供有效的解决方案。基因组编辑技术不同于传统的基因工程手段，它可直接作用在基因组上，实现对DNA序列的插入及敲除、单碱基突变等，在基因功能研究中有着广阔前景。在基因编辑技术早期阶段，基因组编辑主要是通过同源重组方式介导的靶向编辑技术，它的编辑效率很低，应用前景欠佳。
近些年来，人工序列特异性的核酸酶（Sequencespecific nuclease, SSN）发展使得基因编辑技术有了新的突破。目前在基因组编辑领域应用的人工核酸酶主要有：巨核酶（Meganucleases）技术4、锌指核酸酶技术（Zincfinger nuclease, ZFN）5、类转录激活因子效应物核酸酶技术（Transcription activatorlike effector nuclease, TALEN）610以及CRISPR/Cas（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPRassociated）系统11,12。这些核酸内切酶均是通过设计特异序列，靶向特定位点，在目的DNA序列上引入双链断裂（Double strand breaks, DSBs），之后激活细胞自身修复系统非同源末端连接（Nonhomologous end joining, NHEJ），或者以同源重组（Homologous recombination, HR）方式对损伤处DNA片段进行修复13。NHEJ修复机制中，在DNA双链断裂处会发生碱基的丢失、插入或者替换，引起突变的发生。而在HR修复机制中，需有外源片段作为模板实现在特点位点精准突变DNA序列，然而在实际情况下HR发生几率远小于NHEJ途径。
图1 四种人工序列特异性核酸酶作用模式图14
Figure 1 Schematic diagram of four artificial sequencespecific nucleases
Meganuclease含有DNA结合结构域以及核酸内切酶结构域，但其氨基酸残基与目的DNA序列之间没有明确的对应特异性。ZFN系统由一系列Cys2His2锌指蛋白（ZEA）组成的DNA结合结构域和连接在结合结构域C端的Fok I核酸内切酶非特异性的切割结构域串联融合形成。通过对ZFN结合结构域的特异性设计，可实现对靶基因组DNA位点的精准编辑15,16。虽然ZFN在很多物种中都实现了成功靶向基因突变，但由于其设计成本高、操作复杂，且序列的依赖效应会降低编辑效率17,18等限制了ZFN的应用。TALEN将Fok I核酸内切酶中的非特异性的切割结构域取代TALE蛋白中的激活结构域，并与特异性识别的TALE蛋白联结形成TALEN酶。TALE由多个33~35个氨基酸组成的串联重复模块构成，各单元第12、13位有两个可变的氨基酸残基，称作重复可变双残基（Repeat variable diresidue, RVD）19,20。通过将核酸序列按照对应的TAL模块串联就可以实现对特定DNA序列的TALE识别。TALEN相比于ZFN有着便捷的模块化以及构建方便等的优势，再加上它的使用成本更低，使得它在基因编辑领域有着更加广泛的应用21。但是由于TALEN的靶点选择以及组装的复杂性，同样也限制了它的进一步推广使用。2013年，第三代基因编辑技术CRISPR/Cas出现了，这一技术基于细菌或古细菌天然的获得性免疫系统改造而来。与ZFN及TALEN技术不同，CRISPR/Cas识别DNA序列依赖RNA而不是DNA结合结构域，这种方式灵活便捷，目标位点的选择只需满足PAM（Protospacer adjacent motif）序列要求即可。CRISPR/Cas系统操作简单，生产操作成本比ZFN和TALEN低得多，并且具有很高的突变效率，这使其在几年内迅速成为主流的基因编辑技术。
CRISPR/Cas9系统

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