1-萘酚（1-Naphthol）是有机合成工业、医药工业、染料工业的重要原料同时也是除草剂敌草胺和杀虫剂西维因降解的中间体，另外在环境中仍可来源于多环芳烃化合物（PAHs）的生物降解过程，从结构上看，它属于萘的羟基衍生物，具有较高的水溶性，理化性质与苯酚相似，对生物具有强不可逆的毒性伤害，结构稳定。微生物降解是1-萘酚消除的重要手段，废水及污染土壤生物修复的理想方式。但是目前对1-萘酚降解分子机制的了解不清晰，研究其降解关键基因及其调控机制，有助于理解高毒性芳香化合物代谢的分子机理。在前期的研究中，成功鉴定一株能够完全矿化(S)-敌草胺的菌株Sphingobium sp. strain B2。并从其中成功克隆到敌草胺酰胺水解酶基因snaH，SnaH催化敌草胺第一步的水解反应生成二乙胺和萘氧丙酸，萘氧丙酸随后进一步通过α-酮戊二酸依赖型的双加氧酶Snpd断裂醚键生成1-萘酚。接着1-萘酚能够在较长时间内实现完全降解，然而在降解的同时添加其他碳源如葡萄糖可以显著增加菌株代谢1-萘酚的速率，该现象与芳香化合物的共代谢降解定义相符合，推测菌株降解1-萘酚的过程是被调控的。进一步探究1-萘酚的降解途径及相关调控机制具有重要意义。因此本研究将对菌株B2降解过程的关键基因簇进行克隆分析和转录调控机制研究。
目录
摘要 1
关键词 1
ABSTRACT 3
KEY WORDS 3
符号与简略语说明 6
引言
第一节 1萘酚概述 7
1 1萘酚简介 7
1 1萘酚毒性 7
3 1萘酚的微生物降解 8
4 黄素依赖型双组份单加氧酶 9
第二节 LysR和IclR家族转录调控蛋白 13
1 LysR家族转录调控蛋白 13
2 IclR家族转录调控蛋白 14
第一章 Sphingobium sp. strain B2中1萘酚单加氧酶基因簇ndcA1A2B的功能验证 16
第一节 1萘酚降解相关基因的预测 16
1 材料与方法 16
1.1 试剂与培养基 16
1.2 菌株 16
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1.3 基因组DNA的提取与测序 16
1.4 转录组分析 15
2 结果与分析 16
2.1 菌株B2的葡萄糖和1萘酚共诱导降解 16
2.2 转录组分析 17
第二节 1萘酚降解关键基因簇基因orf3894 (ndcA1)的功能验证 19
1 材料与方法 19
1.1 试剂与培养基 19
1.2 菌株与质粒 19
1.3 引物 20
1.4 1萘酚降解过程限速步骤的确定 20
1.5 ndcA1基因的无痕敲除与基因回补 21
2 结果与分析 22
2.1 1萘酚降解限速步骤与关键酶基因簇的确定 22
2.2 ndcA1敲除质粒的构建 22
2.3 ndcA1敲除菌株的筛选 23
2.4 ndcA1敲除菌株降解功能的验证 23
2.5 回补质粒pBBRndcA1的构建及回补菌株ndcA1 KO pBBRndcA1的获得 24
2.6 ndcA1 KO回补菌株降解功能的验证 24
2.7 野生型，ndcA1 KO和ndcA1回补菌株降解速度比较 25
本章讨论 26
第二章 细菌Sphingobium sp. strain B2中单加氧酶基因簇转录调控蛋白Ndc和NdcS的功能确定 28
第一节 限速酶基因簇ndcA1A2B的转录分析 28
1 材料与方法 28
1.1 试剂与培养基 28
1.2 菌株与引物 28
1.3 总RNA的提取 29
1.4 cDNA 5末端的快速扩增（5RACE） 29
1.5 ndcA1A2B共转录的确认 29
1.6 启动子预测验证 30
2 结果与分析 30
2.1 ndcA1A2B基因簇共转录（多顺反子） 30
2.2 启动子特征序列的预测 31
2.3 启动子Pndc功能验证 31
第二节 ndcA1A2B基因簇转录抑制蛋白NdcR和转录激活蛋白NdcS的功能确认 32
1 材料与方法 32
1.1 试剂与培养基 32
1.2 菌株与引物 32
1.3 基因无痕敲除与回补 34
1.4 1萘酚降解与菌株生长测定 36
1.5 荧光定量PCR 36
1.6 (ndcR)ndcA1A2B异源表达与NdcR和NdcS的异源表达与纯化 37
1.7 凝胶阻滞实验（EMSA） 37
1.8 DNase I 足谱印记 (DNase I footprinting assay) 38
1.9 不同诱导物诱导萘酚降解及共代谢实验 38
1.10 生物信息学分析 38
2 结果与分析 38
2.1 ndcR和ndcS敲除菌株及回补菌株的获得 38
2.2 野生型，敲除突变株及回补菌株的1萘酚降解能力 39
2.3 1萘酚的诱导降解与共代谢 41
2.4 荧光定量PCR 42
2.5 (ndcR)ndcA1A2B的异源表达与ndcR和ndcS的表达 43
2.6 凝胶阻滞（EMSA） 44
2.7 DNase I 足谱印记 (DNase I footprinting assay) 45
2.8 NdcR和NdcS的结构分析 46
本章讨论 48
全文总结与展望 50
参考文献 51
附录 55
本科期间发表的论文 57
致谢 58
1萘酚微生物降解关键基因的克隆及转录调控机理研究

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