摘 要锌和锰是植物必需的微量元素，对植物的生长发育以及各项生理生化过程有着举足轻重的作用，但是如果环境中过量存在，则会表现为毒性。当今环境重金属污染严重，锌、锰污染呈蔓延态势，引发一定的生态风险和食品安全问题，因此，解析锌、锰在植物中的转运累积机制就显得尤为重要。现阶段，植物中重金属的吸收转运机理已有一定相关研究，但是OsMTP7基因在水稻中对锌、锰的吸收转运机理还未见报道。本研究对野生型中花11号水稻进行水培实验，分别测定不同锌、锰处理浓度下OsMTP7基因表达量差异，并利用CRISPR/Cas9技术对OsMTP7基因进行敲除，获得OsMTP7功能缺失型突变体，同时从水稻中克隆出该基因，融合GFP标签，构建双元表达载体，进行OsMTP7的亚细胞定位分析。结果表明，OsMTP7基因与水稻在锌胁迫条件下的抗逆性有关， MTP7蛋白定位在液泡膜上，可能通过区室化起到解毒作用；但OsMTP7基因可能不参与水稻锰胁迫条件下的解毒过程。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
前言1
1 材料与方法3
1.1 实验材料 3
1.1.1 植物材料3
1.1.2 菌株材料3
1.1.3 载体材料3
1.2 引物清单 6
1.3 实验试剂 6
1.4 实验仪器7
1.5所用培养基及营养液配方7
1.5.1 固体LB培养基7
1.5.2 液体LB培养基7
1.5.3 水稻Kimura营养液配方7
1.6 实验方法 8
1.6.1 CRISPR/Cas9载体构建8
1.6.2 OsMTP7蛋白的亚细胞定位分析9
1.6.3 水培试验10
2 结果与分析10
2.1 水培表型10
2.2 基因表达量分析10
2.3 亚细胞定位分析11
2.4 OsMTP7基因敲除材料构建12
3 讨论12
致谢14
参考文献15
水稻金属耐受蛋白OsM *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ^351916072* 
TP7基因敲除材料构建及蛋白亚细胞定位研究
引言
前言：金属元素锌（Zn），锰（Mn）都是地壳的组成元素，在自然界普遍存在。同时，锌、锰是植物生长发育的必须微量营养元素，参与了植物体内大量的生理生化过程，缺锌缺锰都会使植物生长滞后，产量下降。但是锌、锰含量过高会表现为毒性，对植物生长发育和人类食品安全造成负面影响[1,24]。
水稻是全球非常重要的粮食作物之一，我国又是世界最大的上稻米生产国和消费国。但随着工业和现代农业的发展迅速，人类活动范围越来越大，环境污染尤其是重金属污染对水稻的安全生产带来了严峻的挑战[5]。重金属在水稻中富集后往往会通过食物链进入人体，引起人体中重金属含量超标，从而影响人体健康，并进而引发一系列社会问题[6]。近年来，由于矿产开采和冶炼“三废”的排放、化肥农药施用及污水灌溉等导致我国土壤中锌、锰污染以不同程度快速蔓延，产生了严重的生态环境风险，土壤环境重金属污染问题的解决刻不容缓。因此，克隆并解析能够影响水稻对锌、锰吸收和积累的功能基因，对研究水稻对其吸收、转运和积累的分子机制以及耐锌锰胁迫植株的培育具有重要的意义。
锌（Zn）是生物所必需的生命元素，锌在土壤各形态中以残渣态为主，平均含量达到了39.30 mgkg1，占67.35%。锌的形态分布为：残渣态＞铁锰氧化物结合态＞弱有机盐结合态＞离子交换态＞强有机结合态＞碳酸盐结合态＞水溶态。锌不仅参与了植物生理代谢活动，而且在蛋白质合成及转运等过程中也发挥着重要作用。然而，过量的锌会产生毒性[7]。
锌在细胞过程中发挥的各种作用是金属离子的多种生物学效用的一个很好的例子。 Zn参与蛋白质，核酸，碳水化合物和脂质代谢。此外，Zn对控制基因转录和由含有DNA结合锌指基序和LIM结构域的蛋白质调节的其他生物过程的协调至关重要。与DNA和RNA合成相关的几种分子也是Zn金属酶，例如RNA聚合酶，逆转录酶和转录因子。Zn是一种非氧化还原活性离子，因此靶向转录因子和参与DNA代谢的其他酶，因为使用氧化还原活性金属离子进行这些任务可能导致自由基反应和核酸损伤。然而，必须严格控制这些过程，以确保在任何时候都存在正确数量的锌。虽然它是必需营养素，但如果它过量积累，则会出现毒性。锌毒性的确切原因尚不清楚，但金属可能与不适当的细胞内配体结合，或与其他金属离子竞争酶活性位点或转运蛋白。为了在细胞中发挥这种不同的作用，并且因为它不能被动地扩散穿过细胞膜，必须将Zn转运到细胞的细胞内区室中，这是这些Zn依赖性过程所需要的。一组称为Zn转运蛋白的蛋白质致力于通过生物膜转运Zn。
锰（Mn）也是一种植物生长和发育所必需金属元素[8,9]，特别是对光合作用的第二个阶段有非常重要的意义。锰也是激活参与DNA合成，抗氧化防御，糖代谢和蛋白质修饰的酶所必需的[810]。锰对于大多数植物而言，其需求量不高，但是当组织锰含量低于20 mgkg1时，生长会受到抑制，其特征是新叶中的萎黄病。同时，如果土壤环境中锰的含量过量，会对植物机体造成伤害，而且还会导致作物产量的降低, 同时, 锰在生物间的迁移存在生物放大作用, 通过生物链进入人体，如人体锰摄入量过高能够影响肝脏、心血管系统和免疫系统的正常功能, 引发一系列病症[11]。
土壤中的锰也有多种存在形态，土壤中能被植物吸收利用的锰称为有效锰，一般将其作为土壤中可给态锰的评价指标，包括水溶性锰、交换态锰和易还原态锰［11,12］，前两种形态的锰都以Mn2+的状态存在，而后者是价数较高的氧化锰中容易还原成植物有效锰的部分。
尽管锰胁迫能够抑制植物的生长和发育，但一些植物却依然能够在高浓度的Mn2+污染的土壤环境中生存，完成其生命周期，对锰胁迫具备很强的耐性，并且被吸收的锰可以在特定部位高浓度累积，进而对植物不产生毒害作用，表明植物在长期的进化过程中亦相应的产生了抵抗锰胁迫的防卫机制。重金属离子在重金属累积植物中的累积过程可能包括4步：(1)土壤中的重金属离子通过跨膜运输进入根细胞；(2)降低根细胞液泡中金属贮存量；(3)增强金属离子由木质部薄壁细胞向木质部的上载, 并转运到地上部的枝和叶；(4)木质部中金属离子跨膜运输至叶片, 并贮存在液泡和细胞壁中[11]。锰在植物的根部被吸收，快速的吸收和高速率的向地上部转运是茎和叶累积锰的前提，而根细胞高效的解毒机制是保障其正常生存的基础；锰由根向叶片长距离运输的主要通道是茎的韧皮部，韧皮部也部分参与了金属离子的运输和解毒作用；锰主要积累在植物的叶片部分，涉及复杂的金属解毒和累积机制[11]。由此可见，在重金属累积植物中，根、茎和叶不同器官对重金属具有不同的解毒机制，在植物抗重金属胁迫方面发挥着不同的作用，植物的重金属超累积特性的形成依赖根、茎和叶的协同作用。

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